大豆RACK1基因RNAi载体构建及植株转化.pdf

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1、南方农业学报JournalofSouthernAgrieuhure2014，45(6)：944—949ISSN2095—1191；CODENNNXAABDOI：10．3969／j：issn．2095—1191．2014．6．944大豆RACKI基因RNAi载体构建及植株转化李大红1，刘喜平1，甄萍萍2(1黄淮学院生物工程系，河南驻马店463000；2临邑县农业局，山东临邑251500)摘要：【目的】筛选大豆RACKl基因的RNAi突变体，为研究RACKl基因在大豆生长发育过程的调控作用提供依据。【方法】采用RT—PCR克隆大豆叶片RACKl基因核心保守序列片段，以植物表达载体pCAMBIA

2、l301为基本载体，构建抑制大豆RAc圈基因表达的RNAi载体。通过农杆菌介导转入大豆子叶节，经潮霉素筛选转基因植株，利用PCR、Southernblot及RT—qPCR进行转基因植株检测。【结果】克隆获得大豆RACKl基因核心保守序列片段432bp；将该基因片段连接：至IjpCAMBIAl301表达载体内含子两侧，通过酶切分析，RNAi载体构建正确。通过农杆菌介导，将该载体转入大豆中黄13号，获得23个转基因大豆株系；经PCR和Southernblot检测，确定大豆RACKl基因RNAi片段已融合到大豆基因组中。经定量RT—qPCR分析，不同转基因大豆株系RACKl基因mRNA的表达量具

3、有明显差异，其在株系5的表达量最高，为对照的68．5％；株系7最低，降至对照的19．9％。【结论】成功构建了大豆RACKlRNAi表达载体并导人大豆基因组中，获得23个农杆菌介导的RACKlRNA干扰表达的大豆转基因植株，为研究RACKl基因在大豆生长发育过程中的功能和作用奠定了基础。关键词：大豆；RACKl；RNAi；载体构建；Southernblot；RT—qPCR中图分类号：$565．1文献标志码：A文章编号：2095—1191(2014)06—0944—06ConstructionofRNAivectorcarryingRACKIgeneandtransformationinsoy

4、beanLIDa—hong1．LIUXi—ping1．ZHENPing—pin92(1DepartnlentofBiologicalEngineering，HuanghuaiUniversity，Zhumadian，Henan463000，China；2AgriculturalBureauofLinyiCounty，Linyi，Shandong251500，China)Abstract：【Objective】TheRNAinmtantofsoybeanRA皤1genewasscreenedinordertoprovidereferencesforstudyingregulationrole

5、ofRACKjgeneintheprocessofsoybeangrowthanddevelopment．【Method]Theconservedse—quenceofRACKlinsoybeanleafwasclonedbyRT—PCR．ARNAiexpressionvectortoinhibitRACKlexpressionwasconstructedbyusingplantexpressionvectorpCAMBIAl301．RACKlgenewastransterredintoeotyledonarynodeofsoybeanZhonghuang13viaAgrobacteriu

6、m——mediatedtranstbmlationmethod．TransgenicseedlingswasscreenedbyhygromycinandwasdetectedbyPCR，SouthernblotandRT—PCR．【Result】TheclonedsoybeanRAG圈genefragmentwas432bp．ThegenefragmentwasconnectedtobothsidesofintroninexpressionvectorpCAMBIAl301．ThroughrestrictionenzynledigestionanalysisandDNAsequencin

7、g．itshowedthatalltherecombinantplasmidswereaccordingwiththedesignandRNAivectorwasconstructedcorrectly．ByA,grobacterium—mediated．theconstructedRNAivectorwastransf()mlatedintosoybeanZhonghuang13and23transgeniclines