大豆耐盐基因GmHAL3a的克隆及RNAi载体的构建-论文.pdf

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1、第32卷第1期大豆科学VOI32Niji2013钜2月S0YBEANSCIENCEFeb．2()l3大豆耐盐基因GmHAL3a的克隆及RI、iAi载体的构建王明霞，崔晓霞，薛晨晨，徐筋燕，薛冬，郭娜，邢邯(南京农业大学国家大豆改良中心，江苏南京210095)摘要：利用同源克隆方法从大豆中克隆到一个耐盐基因HAL3，命名为GmHAL3a，组织表达分析发现GmHAL3a基在大豆根中表达量最高，荚中次之，叶中表达量最低；非生物胁迫实验表明该基冈受№C1、LiC1和山梨醇诱导表达；通过生物信息学的方法分析发现该基因具有2个跨膜螺旋区域，可能定位于叶绿体中；同源序列比对

2、证实该基冈氧基酸序列具有与其他物种相似的保守位点：黄素单核苷酸(FMN)结合位点和磷酸泛酰半胱氨酸(PPC)脱羧酶活性位点。同时扩增了这个基因的2个干扰片段，用Gateway技术将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR221，测序后又通过LR反应分别将目的片段插入到RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ)，再转入根癌农杆菌EHA105中。这2个载体的构建对]二进一一步研究大豆中GmHAL3a基因的功能具有重要意义。关键词：Gateway技术；大豆；RNA干扰；GmHAL3a基因中图分类号：$565．1文献标识码：A文章编号：1000-9841(2013)0

3、1-0012-07CloningofHalotolerance3GeneandConstructionofItsRNAiVectorinSoy-bean(Glycinemax)WANGMing—xia，CUIXiao—xia，XUEChen—chen，XUJin—yan，XUEDong，GUONa，XINGHan(NationalCenterforSoybeanImprovement，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，Jiangsu，Chi㈨)Abstract-Halotoleranee3genewasis

4、olatedfromsoybean(Glycinemn)byhomologychining，designedasGmttAL3a．l'issuespecificanalysisfoundthatGmHAL3aexpressedmainlVjnroot．℃Jative]vIowerinpodandlowestinleaf．RT—PCRreveale(1thattheexpressionofGmttAL3awasinducedbysalt．LiC1andSOrbito1．BioinformaticsanalysisindicatedthatGmHAL3aI1a(1

5、twotransmembranehelicesregionsantitwoconserveddomains，flayinmononucleotide(FMN)bindingsitesand4’一phosphopan—tothen0vlcvsteine(PPC)deearboxylaseactivitysites，andW8Spossiblylocalize(1inchloroplast．WeclonedtwosegmentsofGm—HAL3a，ligasedintoentryclonevector(pDONR221)byBPreaction，an(1then

6、ligasedintoRNAitransformationvectorpB7GW1wG2(Ⅱ)byLRreaction．FinallywetransformedthetwovectorsintoAgrobacteriumtumefaciensEHAJ05．TheresultsprovidefoundationforfurillerresearchthefunctionofGmHAL3ageneinsoybean．Keywords：Gatewaytechnology；Soybean；RNAinterfeFence；GmHAL3ageneHAL3(Halotole

7、rance3)基因广泛存在于动物、且前人在对HM3基因进行功能分析中，也很少用到植物和真菌中，是前人在筛选酵母耐盐基因过程中RNA=F扰(RNAi)方法RNAi是指一小双链RNA分离克隆的耐逆相关基因，而且是一种参与细胞分高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降裂的黄素单核苷酸(FMN)结合蛋白。J。过表达该解，从而使细胞表现出特定基因缺陷表型的过程基因不仅能够通过增强Na／K动态平衡来提高植本研究从火豆中克隆GmHAL3a基因，并用物的耐盐性，还能促进细胞分裂，加速植株生Gateway技术构建其RNAi载体，对HAL3基因在植长4。。研究发现，HA

8、／3具有磷酸泛酰半胱氨酸物中，特别是双