甲基磺酸乙酯诱变加工番茄耐盐突变体耐盐基因的克隆及载体构建.pdf

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1、分类号：密级：学号：2015201308单位代码：10759石河子大学硕士学位论文甲基磺酸乙酯诱变加工番茄耐盐突变体耐盐基因的克隆及载体构建学位申请人张国儒指导教师庞胜群副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称园艺系蔬菜学研究方向蔬菜育种学所在学院农学院中国·新疆·石河子2018年5月CloningandConstructionofSaltToleranceGenesofSalt-tolerantMutantsInducedbyEethylMethaneSulfonate(EMS)inTomatoA

2、DissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByZhangGuo-ru(VegetableHeredityBreeding)DissertationSupervisor:A.P.PangSheng-qunMay2018甲基磺酸乙酯诱变加工番茄耐盐突变体耐盐基因的克隆及载体构建摘要世界上约20%的可耕种面积受到土壤盐渍化和干旱胁迫的

3、影响，这两种胁迫是作物减产主要的非生物胁迫因素。而新疆盐碱地面积是我国分布最广、土壤积盐最重的地区，占全国盐碱土地面积的22.0%。加工番茄是新疆重要的经济作物之一，为缓解土壤盐碱化对番茄生长发育的影响，除土壤改良外，通过提高加工番茄自身的耐盐性，来缓解盐胁迫对加工番茄生长的影响，是最为经济有效的途径。因此，本试验利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变加工番茄“JW9”材料来创造突变体，并以耐盐性为选择目标，筛选出耐盐突变体。利用转录组测序技术分析耐盐基因并进行克隆和表达载体的构建，以期利用转基因技术转化拟南芥

4、验证后获得新的耐盐材料。研究结果如下：1、大田种植观察变异类型：以EMS半致死浓度（3.0%）诱变处理1500粒加工番茄种子10h后单粒播种于穴盘，以清水处理140粒加工番茄种子10h作为对照。在苗期，EMS处理材料共存活725株，对照全部存活，果实成熟后进行单株留种，处理组共存活并收种592株，对照组几乎全部存活。通过田间调查发现一些主要的变异类型，如植株高大、植株矮小、茎不分枝、植株不开花、茎分枝多、雄性不育、无生长点、晚熟、茎粗大；叶片颜色浅绿、叶片卷缩、大叶片、狭长叶、叶片裂缺；果实乳状突起、果

5、顶开裂、葫芦果、条纹果、畸形果等，M1代番茄总的变异类型为26种，总的变异数为133，变异率为8.87%，其中有益突变为植株高大，增加植株光合产能，结实量大；茎变粗，抗倒性强；植株分枝数增多，结果多；花粉败育，造成番茄雄性不育，为杂种优势提供材料。2、利用PCR-SSCP技术筛选耐盐突变体：将大田种植存活的592株处理组和对照组样本进行采样。提取样本DNA，利用SSCP分子标记技术从50对盐胁迫相关基因引物中检测突变体。结果发现，共筛选出22条条带稳定的引物，592株诱变后的植株中，有17份材料与对照材

6、料存在差异条带，多态性检出率为2.87%，在22对引物中，有6对引物共检测出23个多态性位点，从SSCP技术中筛选出的引物占所有可扩增出条带引物的27.27%，占所有筛选引物的12%。3、转录组测序数据分析及筛选耐盐候选基因：对本实验室前期汪斌等人筛选出的16株耐盐突变植株进行转录组测序，分析结果发现，在测序样本中共筛选出4367个基因为样品间的显著差异表达基因（DEGs），其中上调表达基因2606个，下调表达基因1761个。这些显著差异表达基因功能主要涉及次级代谢、代谢调控、激素代谢、信号转导和植物病

7、原菌互作等。经qRT-PCR检测表明，10个随机选择的DEGs表达量变化与转录组测序结果一致。通过GO和KEGG通路富集分析，从具有耐盐功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和ATPase酶合成相关的基因中，找到5个显著差异表达基因包括Solyc08g066270.1和Solyc03g083420.2以及Solyc10g018530.1、Solyc09g082890.1和Solyc02g014190.2可能耐盐相关基因。4、耐盐候选基因克隆：对候选基因进行基因克隆，由转录组测序结果可知其mRNAI甲基磺酸乙酯诱变

8、加工番茄耐盐突变体耐盐基因的克隆及载体构建序列及其大小，利用Blast进行比对后将同源序列相近的基因利用MEGA6找出基因核心序列后利用Primer6设计引物，同时在引物两端加入酶切位点序列。利用提取16株耐盐突变植株总RNA合成的cDNA，进行PCR扩增目的条带并将其克隆到pMD19-T载体进行序列测序验证，检测成功的基因亚克隆至植物过表达载体pCAMBIA2300，构建合适的重组子进行双酶切验证后送测序检验，经测序发现Solyc03g0