shrna介导的rnai载体构建及对肝癌耐药细胞mdr1基因表达的抑制

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1、shRNA介导的RNAi载体构建及对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制【摘要】　　目的：重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体，研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用，以及对P糖蛋白（Pgp）表达和功能的抑制作用.方法：根据MDR1基因序列，设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列（shMDR11，shMDR12），重组构建pshMDR1表达质粒.采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC7721/R，用MTT法测定细胞对化疗药物阿

2、霉素（ADM）的敏感性，流式细胞仪检测细胞膜表面P糖蛋白（Pgp）表达和细胞内Rhdaming123（Rh123）的潴留.结果：PCR和DNA测序证实了pshMDR11和pshMDR12重组质粒的成功构建，均能有效地抑制细胞Pgp表达；转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性，Pgp表达水平明显降低，细胞内的Rh123稳态积累量均明显增高；第1条序列更能有效的抑制MDR1基因表达.结论：体外完成shRNARNAi载体的构建，能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1基因

3、过度表达，抑制Pgp介导的多药耐药.从DNA载体产生的shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi，能够序列特异性地抑制MDR1基因表达.【关键词】RNA干扰；抗药性，多药；短发夹RNA；重组，遗传；质粒；基因表达　　【Abstract】AIM:ToconstructarebinantplasmidgeneratingshorthairpinRNA(shRNA)containingmultidrugresistancegeneMDR1segmentinmammaliancellsandtoinv

4、estigateitssuppressiononMDR1mRNAandPglycoprotein(Pgp)expressionsinhepatocellularcarcinomacells.METHODS:BasedonthedesignoftentsofoligonucleotidesforshRNAexpressionids(pshMDR1)easuredbyMTTassay,PgpexpressionandintracellularRh123accumulationinedbyfl

5、oetry(FCM).RESULTS:RebinantpshMDR1vectorsedbysequencinganalysis.TheycouldsuppressPgpexpressioninhepatocellularcarcinomacells.DrugsensitivityulationofRh123entinSMMC7721/Rcells.TheshMDR11oreeffectiveinthesuppressionofMDR1.CONCLUSION:RebinantpshMD

6、R1vectorcansuppresstheexpressionsofMDR1mRNAandPgpinSMMC7721/Rcells.TheinhibitoryeffectoftheshRNAgeneratedfromtheDNAvectorishighlyrelatedtothetargetsitesandtothedifferentcelllines.　　【Keyultiple;shorthairpinRNA;rebination,geic;plasmids;geneexpression

7、　　0　引言　　肿瘤化疗失败的重要原因之一是肿瘤产生多药耐药（multidrugresistance,MDR）.多药耐药基因MDR1基因的过度表达是导致肿瘤细胞产生耐药的重要机制［1-2］.RNA干扰（RNAi）是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法，它通过将双链RNA（dsRNA）导入细胞后，在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA（siRNA），使与该段RNA同源的目的mRNA产生特异性降解，从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象［3-4］.本实验我们运用PGE1载体，构建

8、了含多药耐药基因（MDR1）的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，观察其对肝癌耐药细胞株SMMC7721/R的MDR1,P糖蛋白（Pgp）表达的抑制作用.　　1　材料和方法　　1.1　材料　　肝癌细胞株SMMC7721为同济医科大学免疫教研室沈关心教授惠赠，本研究所传代培养.SMMC7721/R细胞由本室用阿霉素对其敏感细胞株诱导成功后冻存.宿主菌大肠埃希氏菌SCS1,PGE1质粒及PGE1阴性对照质粒（shneg）,TaqDNA聚合酶,T4DNA连接酶和MgCl2均购自P