shrna%2fmdr1表达载体构建及rnai逆转肝细胞癌多药耐药

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1、声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我～同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢●意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。申请人：j软’挥⋯币：勿厶砌l四JJl大学临床医学博士专业学位论文shRNA／mdrl表达载体构建及RNA

2、i逆转肝细胞癌多药耐药研究生潘光栋导师严律南教授指导教师曾勇教授徐明清副教授杨家印讲师中文摘要研究背景肝细胞肝癌(Hepatocullularcarcinoma,HCC)的是常见的恶性肿瘤之一，发病呈逐年上升趋势，位居我国恶性肿瘤年死亡率的第二位，严重威胁人民群众的身体健康。由于HCC的独特生物学特性，发现时往往已是中晚期，只有30％～40％的患者适合根治性手术，大多数病人依靠化疗或介入化疗，而在化疗过程中，HCC对不同结构和功能的化疗药物产生耐受，即多药耐药(multidrugresistance,MDR

3、)明显影响化疗的效果。为此，克服HCC的MDR是改善其化疗效果的关键。为了逆转HCC的多药耐药性，近年来，各国的科学家一直在研究、寻找有效的方法。从最初的P糖蛋白(P．glycoprotein,P-gp)抑制剂(拮抗剂)、寡核苷酸技术、反义RNA技术到调节MDR相关基因的基因治疗，但均存在抑制效率低或特异性不强、插入突交、细胞毒性等限制，以故未能应用于临床。RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)是近年新发展的一种基因技术，其基本原理是内源性或外源性双链短RNA与细胞内切酶形成诱导沉默复合

4、体(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)。四川大学临床医学博士专业学位论文以siRNA为模板识别其同源基因mRNA，并对其进行递进式剪切，形成强有效的瀑布效应，诱导序列特异的mRNA降解，从而抑制基因表达。具有特异性强、可遗传性、可扩散性、转录后抑制等特点。根据文献报道，在多种肿瘤细胞的多药耐药逆转试验中，siRNA／mdrl表现了很好的逆转效果。目前为止，尚未见RNAi逆转人肝细胞癌多药耐药的体内研究报道，为了探讨RNAi技术能否逆转HCC的MDR，我们课题组在已经完成的实验基

5、础上，设计了如下的实验，希望能为改善HCC的化疗效果和愈后找到一新的、有效的基因治疗措施提供实验支持和理论依据。目的①根据设计原则，设计、合成4—5对siRNA／mdrl，转染耐药细胞HepG2／mdrl，从mRNA、P．gP表达水平和细胞功能变化检测其逆转效率，从中筛选出l一2对高效链；②用高效siRNA／mdrl链构建其sb_RNA／mdrI质粒表达载体pSUPER-shRNA／mdrl，并转染HepG2／mdrI细胞以进一步验证其抑制效率，为体内试验提供实验依据和技术平台；③建立HepG2／mdrl裸

6、鼠移植瘤模型，以shRNA／mdrl-pSUPER进行体内转染，探讨RNAi技术能否逆转动物体内HCC的MDR，为临床应用提供实验支持。方法根据设计原则，设计并根据说明用SilencersiRNAConstruction试剂盒(ABIOM公司)合成5对m斟A(dsRNA)，其中一对为阴性对照，复苏、培养HepGJmdrl、HcpG2细胞至90％密度时，以Oligofectamine转染试剂将合成的dsRNA分别转染细胞，逆转录PCR(RT-PCR)检测mdrl基因的mRNA表达水平，流式细胞术分别检测P．印

7、表达和细胞内柔红霉素积累量，评价细胞耐药性的变化，从中筛选高效抑制的siRNA／mdrl1—2对；同法培养细胞，并于HepG2／mdrl细胞培养液中加入G418和ADM以优化转染条件。根据选出的dsRNA／mdrl，按照质粒载体pSUPER设计要求，合成长64bp的寡核苷酸片段(DNA)，溶解后退火形成双链，2四川大学临床医学博士专业学位论文用BglⅡ和Hindm双酶切pSUPER载体并用胶回收盒回收、纯化DNA载体，1"4DNA连接酶连接退火的DNA双链和酶切后的载体，形成重组质粒pSUPERoshRNA

8、／mdrl，重组质粒转化感受态大肠杆菌，抗生素筛选阳性大肠杆菌克隆，将阳性克隆培养后用PCR验证，PCR产物电泳证实，将筛选出来的阳性克隆质粒pSUPER-mdrl—shRNA送上海生工公司进行基因测序证实构建的质粒携带的siRNA／mdrl为我们筛选出来的序列。把阳性克隆的大肠杆菌用LB液体培养基过夜培养，用上海生工公司去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，质粒纯化后转染HepG2，mdrl细胞，同时设阴性对照组。新