人卵巢癌中多药耐药基因与多药耐药相关蛋白的表达及

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　　人卵巢癌中多药耐药基因与多药耐药相关蛋白的表达及【关键词】卵巢癌［Abstract］ObjectiveTostudytherelationshipbetultidrugresistancegene（MDR1），multidrugresistanceprotein（MRP）otherapybeforeoperation.MethodsTheexpressionofMDR1andMRPin68casesofovariancancerand20normalovarytissueerasechainreaction（RT-PCR）.ResultsInnormalovaryandovariancancer，thepositiveofMDR1or（P<0.05），butnosignificantrelationshiptothehistologicaltype（P>0.05）.ThenonresponderstobinationchemotherapyexhibitedhigherrationsofMDR1andMRPexpressionthantheresponders（P<0.05）.ConclusionMulitplegeneexpressionisinvolvedindrugresistanceinovariancancer.TheexpressionofMDR1orMRPishigherinovariancancerthanthatinnormalovarytissue.TheexpressionofMDR1andMRPiscloselyrelatedtothetumordifferentiationandtheresponseto chemotherapy.［Keys;genesexpression;MDR1;MRP卵巢癌是女性生殖系统主要的恶性肿瘤之一，其病死率居妇科肿瘤首位，占女性癌症患者病死率的第5位。化疗是治疗卵巢恶性肿瘤的主要辅助手段，但癌细胞的耐药严重妨碍了抗肿瘤药物效能的发挥。国内外研究表明，肿瘤耐药涉及细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变、代谢解毒、DNA损伤修复功能增强等多种机制，与多种耐药相关基因有关［1］。本研究采用定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PDR）同时测定多药耐药基因（MDR1），多药耐药相关蛋白（MRP）在卵巢恶性肿瘤组织中表达。旨在探讨卵巢癌MDR1和MRP表达与化疗耐药的关系，从而寻找一种可以预测化疗耐药的标志物。1资料与方法1.1一般资料选择2005年1月~2006年12月间在我院妇产科手术治疗的卵巢癌患者共68例，年龄19~65岁，平均51.7岁。所有手术标本均经病理检查证实。另取正常卵巢组织20例作为对照（系子宫肌瘤手术同时切除卵巢获得的正常卵巢组织）。卵巢癌包括子宫内膜样癌10例，透明细胞癌8例，浆液性乳头状囊腺癌（浆液癌）25例，黏液性乳头状囊腺癌（黏液癌）17例，无性细胞瘤2例，内胚窦瘤6例。其中，临床Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期42例，Ⅳ 期12例，患者均在术后1周内开始化疗。共接受了6~13个疗程的化疗。化疗方案以CAP（顺铂+阿霉素+环磷酰胺）或泰素加PC（顺铂+环磷酰胺）方案为主。1.2方法1.2.1标本收集所有病例均为初诊患者，术前均未接受化疗，在手术切除后1h内，将新鲜癌组织标本置于液氮中保存。1.2.2引物设计根据从Genbank中查到的这两种基因序列设计聚合酶链反应（PCR）引物，见表1，内参基因为肌动蛋白（β-actin）。表1PCR引物及产物长度1.2.3RNA提取参照TRIZOL试剂盒（美国GIBCOBRL公司）说明书进行提取RNA。1.2.4逆转录（RT）合成CDNA将RNA稀释为1μg/μl。取5μlRNA加5×RTbuffer4μl，dNTP（2mmol/L）1μl，Oligo（dT）（100μg/μl）2μl，三蒸水3μl，65℃水浴变性5min，加Rnasin（20u/μl）0.5μl，AMV（10u/μl）1μl，（均为美国Promega公司产品）。42℃水浴60min。95℃5min灭活AMV。1.2.5PCR扩增扩增体系：10×buffer1μl，dNTP（2mmol/L）1μl，引物（5μmol/l）各1μl，甲酰胺5μl，Cdna100ng，TagDNA聚合酶（4μg/μl）0.3μl，加三蒸水补充体积至10μl。94℃变性5 min后进入循环，94℃变性40s，55℃（68℃）退火40s，72℃延伸1min，30个循环后72℃10min。1.2.6电泳80V电压下，2%琼脂糖凝胶电泳1h，紫外光下检查有无特异条带。1.2.7PCR产物定量分析用KODAK数字成像系统对PCR产物照相，用软件分析条带吸光度值。1.2.8临床疗效评定标准对化疗反应的评价参考WHO标准［2］，观察至少6个疗程。临床完全缓解（CR）：临床症状消失，盆腔检查及B超检查均无包块，血清CA125值下降至正常；临床部分缓解（PR）：临床症状消失，病灶缩小>50%，无疾病进展表现，血清CA125值较术前明显下降但未达正常；临床无效（NR）：临床症状存在，病灶缩小<50%，盆腔检查或B超检查有包块，病灶增大或复发，血清CA125值未下降或下降后又再升高。若病情在3个月内急剧加重，视为无效。CR和PR均视为临床治疗有效，NR为临床治疗无效，即为耐药。1.3统计学方法用SPSS统计软件进行χ2检验。2结果2.1MDR1与MRP的表达MDR1在正常卵巢组织和卵巢癌组织中的阳性表达率分别是0和35.2%。MRP在正常卵巢组织和卵巢癌组织中的阳性表达率分别是10.7%和49.9%。2.2MDR1与MRP的表达与临床分期和病理的关系 2.2.1MDR1与MRP的表达与临床分期见表2。表2不同临床期别的卵巢癌中MDR1与MRP的阳性表达情况从表1中看出，Ⅲ期和Ⅳ期中MDR1与MRP的阳性表达率明显高于Ⅰ期和Ⅱ期，但由于Ⅰ期和Ⅱ期例数少（不足10例），两者比较，差异无统计学意义。2.2.2MDR1与MRP的表达与病理见表3。表3不同病理特征中卵巢癌MDR1与MRP阳性表达情况注：*例数少于10例者不计百分率从表3中可以看出MDR1在浆液癌中阳性表达率低于其他类型卵巢癌，但仅与透明细胞癌比较差异有显著统计学意义（P<0.05）。MRP在各型卵巢癌中阳性表达率差异无统计学意义（P>0.05）。低分化卵巢癌的MDR1与MRP的阳性表达率分别是48.8%和68.3%，明显高于中、高分化卵巢癌的7.4%和29.6%（P<0.05）。2.3MDR1与MRP表达与化疗耐药68例接受化疗患者中，术后1年，42例临床治疗有效，26例临床治疗无效，视为临床耐药。临床Ⅲ 期接受化疗患者42例，23例临床治疗有效，19例临床治疗无效，视为临床耐药。两者的年龄、病理类型、病理分化程度、手术切除程度、化疗方案以及疗程数比较均无明显差异。23例临床治疗有效者MDR1与MRP的阳性表达率分别是13.04%和34.78%，19例临床治疗无效者MDR1与MRP的阳性表达率分别是52.63%和89.47%，化疗有效者和化疗无效者MDR1与MRP的阳性表达率比较，其差异有统计学意义（P<0.05）。临床Ⅳ期接受化疗患者12例，5例有效，7例无效。两者的年龄、病理类型、病理分化程度、手术切除程度、化疗方案以及疗程数比较均无明显差异。5例有效者中MDR1阳性表达者1例，MRP阳性表达者2例。7例无效者中MDR1阳性表达者3例，MRP阳性表达者5例。3讨论　　肿瘤耐药是多基因参与的结果，了解耐药基因的表达，对于选择合适的治疗方案，判断预后和寻找有效的逆转肿瘤耐药的方法都是有益的。 3.1化疗耐药与MDR1表达的关系MDR1是第1个确定的多药耐药相关基因，基因编码了相对分子量为170000的P-糖蛋白（P-gp）。P-糖蛋白位于细胞浆膜，其作用是将细胞内的一些化疗药物泵出细胞外，从而使肿瘤耐药。这些药物包括长春新碱类、放线菌素类、蒽环类抗生素、鬼臼毒素及衍生物等［3］。国内外的研究表明，正常卵巢组织MDR1基因表达水平极低甚至无表达［4］。我们的研究结果与之一致。本研究中，20例正常卵巢组织中均无MDR1表达，而在68例初诊未经化疗的卵巢癌患者中有35.2%的MDR1基因表达阳性，这些患者MDR1基因的表达非化疗诱导，提示在卵巢癌中可存在固有性的MDR1基因表达。低分化肿瘤的MDR1阳性率为48.8%，显著高于中、高分化肿瘤的7.4%（P<0.01）。提示低分化肿瘤存在原发耐药倾向，MDR1阳性患者的化疗疗效较差。Ⅲ期和Ⅳ期中MDR1的阳性表达率分别是30.9%和33.3%，高于Ⅰ期和Ⅱ期。浆液性囊腺癌中MDR1的表达是16.0%，低于其他类型卵巢癌。临床Ⅲ期化疗有效者MDR1阳性表达率是13.04%，明显低于化疗无效者。以上几项数据说明MDR1阳性表达与临床期别、病理类型和化疗疗效也有关。3.2化疗耐药与MRP表达的关系MRP是近几年发现的与药物转运有关的耐药相关蛋白。MRP和P-gp同属ATP依赖性跨膜转运蛋白，MRP表达增强可以使细胞主动将进入细胞内的药物排出细胞外，导致细胞内药物浓度减低，改变药物在细胞内的分布［1，5］。Kavallaris等［6］采用RT-PCR测定了53例初治卵巢癌的MDR1和MRP表达，结果36.0%表达MDR1，但表达量较低，而所有患者均表达，其中92.0%卵巢癌患者的MRP表达量高于正常卵巢组织，但未证实MRP表达与预后有关。Izquierdo等［7］采用免疫组化法测定了57例临床Ⅲ~Ⅳ 期的卵巢癌组织，患者在细胞减灭术后均接受了以铂类和烷化剂为主的化疗，结果发现MRP和P-gp的阳性表达率分别为68.0%和16.0%，MRP和P-gp的阳性表达率与化疗疗效和生存期无关。本研究中，MRP在正常卵巢组织中的阳性表达率为10.7%，明显低于卵巢癌组织中的49.9%（P<0.05）。本研究中发现MRP的表达与临床期别、病理类型、病理分化程度和化疗疗效均有关。根据研究结果并结合文献分析，MDR1与MRP的阳性表达水平和临床分期、肿瘤病理分化程度等临床因素与化疗敏感性有一定关系，有可能成为筛选化疗药物、判断患者预后的重要指标。因此有必要进行深入的相关研究，进一步证实MDR1与MRP在耐药中的作用，这对于阐明耐药机制并逆转耐药、提高卵巢癌的化疗疗效、改善预后均有重大的意义。【