sirna逆转肺耐药相关蛋白表达介导的白血病细胞多药耐药

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1、SiRNA逆转肺耐药相关蛋白表达介导的白血病细胞多药耐药【关键词】RNA，小分子干扰；基因，肺耐药相关蛋白；K562细胞；抗药性，多药　　【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectofshortinterferingRNA(siRNA)onexpressionandfunctionoflungresistancerelatedprotein(LRP)inthemultidrugresistanthumanleukemiacells(K562/NaB).METHODS:MultidrugresistantK562cellsbutyrate(NaB)

2、,odelsystem.LRPspecificsiRNARNAerasechainreaction(RTPCR),andproteinlevelandintracellulardaunorubicin(DNR)accumulationinK562/NaBcellsetry.50%inhibitionconcentration(IC50)ofadriamycin(ADM)onK562/NaBcellsethod.RESULTS:LRPmRNAlevelpositiveresulttonegativeresult.IntracellularDNRaccumulationeanfluo

3、rescenceofDNReshigher.TherelativeefficiencytoADMultidrugresistanceofleukemiacellsinducedbyLRP.　　【Keyallinterfering;gene,lungresistancerelatedprotein;K562cells;drugresistance,multiple　　0引言　　肺耐药相关蛋白（lungrelatedresistantprotein，LRP）是一种新型的与多药耐药（multidrugresistance，MDR）相关的糖蛋白，主要导致细胞内药物聚集缺陷，而在多种

4、肿瘤细胞内引起MDR.在儿童白血病以及成人髓系白血病（AML）中，LRP表达是独立的预后决定因素之一，其过度表达造成患者对化疗不敏感，提示预后不良［1-2］.双链短干扰RNA（shortinterferingRNA，siRNA）介导的RNA干扰（RNAinterference，RNAi），是在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面的最新突破［3-4］.我们在建立了经丁酸钠（sodiumbutyrate，NaB）诱导人AML系K562细胞，高表达LRP并介导多药耐药的细胞模型（K562/NaB）的基础上［5］，设计合成了LRP特异性siRNALRP，并转染上述细胞模型，观察siRNALR

5、P抑制LRP基因和蛋白表达、消除LRP改变细胞内药物蓄积和分布作用的效果，以期为逆转LRP介导的肿瘤细胞MDR、提高儿童难治性和复发性白血病化疗效果探索新的方法，并探讨以siRNA介导的RNAi用于肿瘤细胞MDR治疗的可行性.　　1材料和方法　　1.1材料　　AML细胞系K562细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所；单克隆抗体LRP56为Monosan公司产品；固定和破膜试剂盒、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）荧光标记羊抗鼠IgG抗体为CaltologLaboratories产品；NaB为Sigma公司产品.　　　　LRP特异性短干涉RNA(siRNALRP)自行设计

6、，由Dharmacon公司合成.浓度20μmmol/L，序列：5′GCUCUUUUCAGUGCCAGACdTdT（正义链），dTdTCGAGAAAAGUCACGGUCUG5′（反义链）.　　1.2方法　　1.2.1K562细胞培养和高表达　　LRP的K562多药耐药细胞模型（K562/N）［10］K562细胞在含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养基于37℃,50ml/LCO2条件下培养.K562细胞在含2mmol/LNaB的培养液中处理3d，制作K562细胞高表达LRP的多药耐药细胞模型，命名为K562/NaB.阴性对照组不加NaB.　　1.2.2siRNA转染　　实验K

7、562/NaBsiRNA组：取K562/NaB细胞接种于24孔板内，每孔500μL，浓度为3×108/L.分别以无血清RPMI1640培养液50μL稀释siRNALRP,Lipofectamine各1μL，混匀静置后加入细胞悬液.再加入NaB使终浓度为2mmol/L，进行细胞培养.每24h以含2mmol/LNaB的RPMI1640培养基500μL换液，连续3d.转染后24,48,72h分别取细胞进行相关检测.　　　　K562/NaBH2O组：取K562/NaB细