腺病毒载体的构建

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1、腺病毒载体的构建病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，分子量为150MDa，直径约为950，它是已知最大和最复杂的无包膜DNA病毒之一。腺病毒广泛存在于自然中，能通过呼吸道、消化道、眼黏膜等途径感染动物和人，无论增殖和非增殖细胞均可以被感染，但对人类的致病性低。由于腺病毒和人类基因组同源，感染后不会整合到人染色体中，不会导致染色体突变。因此，将腺病毒作为抗原呈递载体构建疫苗，具有高效、安全、给药方便的优点，可以激发机体天然免疫反应，同时便于保存及成本易控，这些优势使得腺病毒载体成为疫苗研究的热点。同源重组方法构建腺病毒载体是目前公认的效率较高的方法，但由于受到36Kd腺病毒DNA

2、碱基数量过大影响，实际效率不高。GibsonAssembly方法是近些年由Dr.DanielGibson发明了一种新的方法，可以容易的将多个线性DNA片段组合到一起。本研究采用传统同源重组与GibsonAssembly两种方法对腺病毒载体进行构建，并做出对比与评价。　　1材料和方法　　1.1主要材料　　质粒pBR322、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DY330、E1区、E3区、蛋白IX缺损的4型腺病毒以及Hela229细胞由中国军事医学科学院8所提供，经PCR及酶切鉴定无误。质粒提取试剂购买于威格拉斯公司，电击仪、1mL电击杯购于Bio-RadMicropulserT

3、M公司，GibsonAssemblyMix试剂购买于NEB公司，Q5Taq酶购买于NEB公司，限制性内切酶购买于宝生物公司。　　1.2实验方法　　1.2.1腺病毒感染繁殖和DNA提取E1区、E3区、蛋白IX缺损的Ad4感染入Hela229细胞，10%胎牛血清EMEM37℃温箱培养72h，使病毒在细胞内增殖。反复冻融数次，破坏细胞壁后收集至20mL超滤管5000g离心30min，使含有病毒的培养液浓缩。加入BafferA2mL(100mmol/LTris、150mmol/LNaCl、12.5mmol/LEDTA)到20mL超滤管5000g离心，反复洗涤4次后加入等体积Baffe

4、rB(100mmol/LTris、150mmol/LNaCl、12.5mmol/LEDTA、2%SDS)及1/50体积蛋白酶K，50℃反应30min。酚氯仿抽提及乙醇沉淀得到纯净的DNA。-80℃冰箱保存备用。　　1.2.2同源重组方法构建腺病毒载体　　1.2.2.1腺病毒载体质粒骨架(pBR-4VLR)构建pBR322质粒用限制性内切酶HindIII切成线性。用PCR扩增两条同源壁，一端(40bp)与pBR322同源，另一端与AD4两端同源。左臂长974bp，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTG，下游引物GACGAGCAGGCGATTCA

5、GAAC;右臂长853bp，上游引物GCCTCAGGAACAACGATGGAA，下游引物CACAAAAAAAATAAGGTATATTATTGATGA。在DY330中同源重组，使同源臂链接在pBR322上。　　1.2.2.2打靶感受态制备取5μLDY330细胞接于5mL无抗性培养液中，30℃摇床增殖12～16h。取增殖后的菌液300μL加入15mLLB，30℃摇床培养2h，42℃水浴摇床培养12min，冰浴30min，用离心机7500r/min和无菌水在4℃条件下洗涤3次。10%甘油重悬1mL，4℃12000r/min离心机中再洗涤1次，10%甘油200μL重

6、悬。　　1.2.2.3同源重组取40μL感受态细胞、AD4DNA10ng和pBR-4VLR1.5ng于电击杯中，电击仪电击。电击打靶条件:电压1.5kV，电阻300Ω，电容2.5μF。加入无抗LB1mL稀释，取出500μL涂琼脂平板，置入30℃温箱培养过夜，挑平板中单菌落作鉴定。　　1.2.3GibsonAssembly方法构建腺病毒载体　　1.2.3.1原料扩增pBR322为载体骨架，将3.6kb的AD4DNA分成AD-1、AD-2、AD-3、AD-44段，均用PCR方法扩增，5段原料两侧均设计30bp左右的同源臂。pBR322段(2kb):Q

7、5Taq，上游引物ATTATTGATGATGCGATCGCCATCGGTATCATTACCCCCATG，下游引物TATATTATTGATGATGCGATCGCGAATTCTTGAAGACGAAAGGGCC;条件为98℃预变性5min，98℃30s、64℃30s、72℃1min，3个循环;98℃10s、72℃1min，27个循环;最后72℃延伸2min。PCR产物胶回收纯化。AD-1段(8.6kb):Q5Taq，上游引物CTATCTATATAATATACCTTATTTTTTTTGTGTGAGTTAATAT