关于大鼠微小ｒｎａ－２２腺病毒载体的构建

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1、关于大鼠微小ＲＮＡ－２２腺病毒载体的构建　　微小RNA(microRNA，miR)是一类长18～24个核苷酸的高度保守的非编码RNA，主要通过结合mRNA　3′非翻译区调控翻译，并可微调细胞信号转导通路和细胞发育过程中的蛋白质。大量研究表明，许多细胞内外miR的改变与心肌梗死、心力衰竭、心肌病和心律失常等心血管疾病相关。近年有文献报道，miR在机体内含量的改变与心肌缺血再灌注损伤的发生、发展也有着密切的关系。但有关miR-22在心肌缺血再灌注损伤这一病理过程中的作用及其调控机制鲜见报道。

2、本研究旨在通过miR-22腺病毒载体的构建、鉴定，腺病毒的包装、扩增、纯化等实验过程，获得具有一定滴度含miR-22基因的重组腺病毒，为后期研究miR-22在心肌缺血再灌注损伤中的作用及分子机制奠定基础。　　1　材料与方法　　1.1　大鼠miR-22腺病毒表达载体的构建和鉴定　　根据文献查阅，化学合成两端含AgeⅠ、EcoRI酶切位点的目的基因(5′端下划线为AgeⅠ酶切位点，3′端下划线为EcoRI酶切位点)：ACCGGTTCCTCCCCTTCCCTCTAGGAACCTGT

3、GCCTCCCACACGCTCACCTGGCTGAGCCGCAGTAGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTATGTCCTGACCCAGCTAAAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTTGCCCTCTGCCACTGGCTTCGAGGAGGAAGAGGAGGAGCAGCTTCTTTGCCTATCATCTGGAAGGTGACAGAACTGGGGTTGGGAAGGTCTGGACAGCTGGGGTGACGGCTTTACAGTTTTTGAATTC(miR-22)。以得到的目的基因为模板，行PCR扩增，且对扩

4、增产物进行AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切。用AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切腺病毒载体GV202以使其线性化，并与同样被AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切的目的基因进行连接。将连接好的产物转化为大肠杆菌DH5a感受态细胞，对生长的克隆进行酶切鉴定和测序比对，鉴定阳性、测序比对一致即为构建成功。　　1.2　腺病毒载体的包装　　以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取构建的miR-22腺病毒重组质粒DNA和辅助包装质粒pBHG　loxΔE　1，3Cre　DNA，将提取的质粒DNA溶于除菌的TE缓冲液中，以紫外光

5、吸收法测定其浓度及纯度，保证所提取质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0。灭菌离心管中加入上述制备的质粒DNA　5μg与DMEM混合均匀，调整总体积为50μl，室温下温育5min。取10μl脂质体2000试剂在另一灭菌管中与50μl　DMEM混合，室温下温育5min。把上述稀释后的DNA与脂质体2000进行混合，室温下温育20min，以形成DNA与脂质体2000稀释液的转染复合物(此过程不要振荡)。将所得的转染复合物转染至细胞状态好、传代次数少的人胚肾293细胞培养液

6、中，混匀，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。6～8h后弃去含有转染混和物的培养液，加入含10%血清的细胞培养液5ml继续培养，每天观察转染后细胞生长状况。显微镜下观察，若细胞出现病变、脱壁等现象，提示腺病毒包装成功。收集富含腺病毒颗粒的人胚肾293细胞上清液，-70℃保存备用。　　1.3　重组腺病毒的扩增和纯化及滴度测定　　第一轮扩增：将1个T25细胞培养瓶中生长状态良好的人胚肾293细胞4倍稀释后传入另1个T25细胞培养瓶中，以含10%FBS的DMEM培养液在37℃，5%CO2下培养(以下扩增

7、中均使用此条件培养细胞)。待细胞达到60%汇合时，弃去培养液，向培养瓶中加入复制缺陷型腺病毒重组成功后收获的粗提液2ml，将培养瓶置于细胞培养箱中孵育90min，最后再向培养瓶中补加完全培养液3ml并继续培养。待大部分细胞出现典型的细胞病变，且有50%细胞脱壁时，通过低速离心等实验过程，收集病毒上清液于-70℃保存。第二轮扩增：将1个T25细胞培养瓶中生长状态良好的人胚肾293细胞全部转入到1个T75细胞培养瓶中，以完全培养液继续培养。待细胞达到90%汇合时，弃去培养液，向培养瓶中加入第一轮扩增所得

8、的病毒液2ml，置于细胞培养箱中孵育90min，最后再向培养瓶中补加完全培养液10ml并继续培养。待大部分细胞出现典型的细胞病变，且有50%细胞脱壁时，通过低速离心等实验过程，收集病毒上清液于-70℃保存。将第二轮扩增所得的重组腺病毒上清液按Adeno-XTMVirus　Purification　Kit(BD　Biosciences，Clontech)的步骤进行纯化，用纯化后的重组腺病毒感染人胚肾293细胞，按照终点稀释法计算腺病毒的滴度值，病毒滴度=10(x+0.8