angiopoietin-1腺病毒载体构建及其在糖尿病大鼠肾脏的表达

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1、遵义医学院硕十学位论文Angiopoietin一1腺病毒载体构建及其在糖尿病大鼠肾脏的表达第一部分重组Ang．1腺病毒载体的构建1实验材料与仪器材料与方法1．1质粒、菌种和细胞质粒pMDl8一Ang-1购自InvivoGen公司；HEK293细胞购自美国Invitrogen公司，大肠杆菌DH5a为遵义医学院微免实验室提供。1．2主要仪器仪器名称你仪器来源cat．No．PCR仪AppliedBiosystems公司2720thermalcycler荧光显微镜奥林帕斯公司micropublisher3．3R1弋，凝胶成像仪天能公司细菌摇床华利达实验设备公司HI．9211K细菌

2、培养箱上海一恒科学仪器有限公司高速离心机日立公司TGL．16G．A荧光显微镜奥林帕斯micropublisher3．3RTVC02培养箱日本三洋SANYOMC0．175生物安全柜上海空气净化设备有限公司Bio1200．II-A2蛋白电泳仪上海天能VE．180蛋白转膜仪上海天能VE-1862主要实验试剂试剂名称试剂来源1kpDNAladderMarker250bpDNAladderMarker琼脂糖EcoRIT4DNAligaseT4DNAligasebufferFermentas公司捷瑞公司赛百盛公司NEB公司．5．cat．NO．SM0311DL250+，100TGA4—

3、100R0101VM0202V遵义医学院硕十学位论文Angiopoietin一1腺病毒载体构建及其在糖尿病大鼠肾脏的表达TaqpolymeraseTakara公司DR010sdNTPpromega公司1211．122Primer上海吉凯基因技术有限公司合成Plasmid抽提KitQlAGEN公司12163胎牛血清(FBS)上海微科生化试剂有限公司A11．102DMEMGIBCO12800．017Lipofectamine2000Invitrogen’11668-500一抗Mouseanti．GFPSanta．CruzSC．9996一抗Mouseanti．beta．acti

4、n碧云天AAl282．1培养基及配制(1)LB液体培养基：109蛋白胨，59酵母提取物，109NaCl，溶于800ml蒸馏水，调节pH至7．O，加蒸馏水定容到1000ml，经高压蒸汽灭菌后保存。(2)LB固体培养基：在LB液体培养基中加入1．5％(w／v)琼脂粉。(3)0．1mol／LCaCl2溶液：称取无水CaCl20．339，溶于30ml水中，以O．45过滤除菌，4"C保存。(4)SOB：lml250mmol／LKCl2溶液加入100mlLB，以5mol／LNaOH调PH值至7．0，高压灭菌，临用前加入0．5ml2mol／LM：gCl2溶液。3实验方法3．1pDC31

5、5-GFP-Ang-1穿梭质粒构建和鉴定3．1．1引物设计及Ang．1基因PCR扩增根据Ang一1基因全长和质粒pDC315-GFP中的多克隆位点，用软件PimerPremier设计一对引物，委托上海吉凯基因化学技术有限公司合成。上游：5。GTAGAACGCAGATCGAA：丌CATGACAGT丌TCCT丁TCCTTTG3。：下游：5‘CCCTTGCTcACCATGAA丌Cc．丌ATCGTCGTCATCCTTGTA3。；以质粒pMDl8-Ang一1为模板经PCR扩增Ang-1基因。按表1反应体系进行PCR-．6．遵义医学院硕+学付论文Angiopoietin一1腺病毒载体

6、构建及其在糖尿病大鼠肾脏的表达表1Ang-1基因扩增的PCR反应体系PCR反应体系：阴性对照组以n阳性对照组@1)实验组以1)Primer(+)0．4O．4Primer(．)0．4O．4ddH2014．710xbuffer2MgCl20．5DNTPs(，2．5mM)0．80．8pfupolymerase0．2Template(10ng／∥1)1循环条件：94℃，预变性30s，94℃变性30s，55℃，退火45s，72℃，延伸3min，30个循环，72℃延伸10分钟。取私lPCR产物进行1．0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射灯下观察电泳条带并用凝胶成像系统拍照。3．1．2Ang

7、．1基因酶切经琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增到Ang．1基因后，用DNAExtractionkit纯化PCR产物，纯化产物用EcoRI进行单酶切，酶切反应体系见表2：表2ABg-1基因酶切反应体系37‘C水浴箱内反应3h，取酶切产物做1．0％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射灯下观察电泳结果。并用DNA凝胶回收试剂盒回收获取Ang一1基因。3．1．3pDC315-GFP质粒酶切用小量抽提试剂盒提取pDC315-GFP质粒，以EcoRI对所提质粒进行酶切消化，酶切反应体系见表3：遵义医学院硕十学何论文Angiopoietin一1腺病毒载体构