人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细

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1、人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细【关键词】内皮抑素腺病毒基因治疗抗血管治疗乳腺癌　　0引言　　近年来，阻止肿瘤血管生成，控制肿瘤的生长和转移，成为肿瘤治疗的一项新策略［1，2］，其中采用转染血管生成抑制剂拮抗血管的生成，以内皮抑素最为理想［3］。本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒表达载体，研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达，为进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备。　　1材料与方法　　1.1材料　　携带人内皮抑素基因（humanendostatin,hE）的质粒pBlasthEndostatin购于美国InvitroGen公司

2、；腺病毒载体pCA13、pBGHE3及293细胞株购于MicrobixBiosystems公司；人乳腺癌细胞株MBD231和MCF7、人脐静脉内皮细胞株ECV304购于美国ATCC细胞库；LipofectAMINE2000转染试剂盒购自GibcoBRL公司；各种限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司；QIAprepspinminiprepkit、QIAampDNABloodMiniKit购自QIAGEN公司；MPERMammalianProteinExtractionReagent购自PIERCE公司；成瘤蛋白的信号肽，构建成功pA

3、dhE。　　1.3携带hE基因的腺病毒AdhE的重组与鉴定　　培养293细胞至对数生长期，采用Lipofectamine2000，将质粒pAdhE与pBGHE3(缺失188～1339bp的5型腺病毒)共转染至293细胞内进行同源重组。转染后10～14d出现病毒空斑，经病毒空斑纯化，应用QIAampDNABloodMiniKit提取腺病毒DNA，应用引物P1和P2进行PCR鉴定。鉴定正确者命名为AdhE。采用293细胞进行病毒的扩增，以氯化铯梯度离心进行病毒纯化，测定病毒滴度。　　1.4免疫荧光和免疫印迹检测hE在乳腺癌细胞中的表达　　在

4、6孔板上接种人乳腺癌细胞株MBD231和MCF7，1×104个细胞／孔，以重复感染度（MOI）为10的感染强度，感染重组病毒AdhE。继续培养48h后，收集细胞。取少量细胞悬液滴在玻片上，进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察hE的表达。其余细胞以MPERMammalianProteinExtractionReagent裂解后回收蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中70V恒压电泳，分离蛋白质，3V，90mA条件下用电转移仪将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，进行OI＝100、10、1、0.1、0.01、0分别感染重组腺病毒AdhE或AdLacZ后继

5、续培养，在病毒感染后第3d,用10%结晶紫福尔马林溶液固定10min，龙胆紫染色。　　2结果　　2.1腺病毒载体质粒pAdhE及重组腺病毒AdhE的鉴定见图1A～1B　　图1腺病毒载体质粒pAdhE及重组腺病毒AdhE的鉴定（略）　　A:质粒EcoRI＋XbaI双酶切，1pCA13；2pAdhE；3LambdaDNA／EcoRI＋HindIII。B：重组病毒PCR扩增，1100bpDNALadder；2AdhE；3阴性对照；4pBlasthEndostatin阳性对照。　　2.2基因表达的鉴定　　乳腺癌细胞株MBD231和MCF

6、7以MOI＝10感染重组病毒AdhE后，进行免疫荧光标记，荧光显微镜下观察hE的表达。结果发现MBD231和MCF7细胞株阳性表达hE的百分比分别为（67.3±12.5）%和（46.8±15.6）%，见图2A、2B。　　图2hE基因表达的鉴定（略）　　A：免疫荧光标记显示MBD231细胞感染AdhE后hE表达明显。B：BD231和MCF7感染AdhE后hE表达阳性，阳性程度高于100ng标准对照，而无病毒细胞培养上清阴性。　　2.3重组腺病毒表达hE的活性　　ECV304以不同的MOI值感染重组腺病毒AdhE后，随MOI的增

7、高，ECV304的生长被明显抑制，而同时感染对照腺病毒AdLacZ的细胞的生长不受影响，见图3。　　图3重组腺病毒AdhE表达hE的活性（略）　　3讨论　　内皮抑素是胶原18的降解产物，降解过程至少包括两步酶解，参与酶解的可能有弹性蛋白酶、组织蛋白酶L和基质金属蛋白酶［4］。内皮抑素能特异性抑制血管内皮细胞在VEGF、bFGF等诱导下的增殖,抑制内皮细胞的迁移，诱导内皮细胞凋亡，但对非内皮细胞，如平滑肌细胞、成纤维细胞等均无抑制作用[5]。内皮抑素这一特点，为抗血管生成的肿瘤基因治疗策略开辟了道路。通过载体转导内皮抑素基因使其在体内长期、稳

8、定表达生物活性高的内皮抑素，这种方法从蛋白质水平转移到基因水平，具有生产简便，在体内表达产物的生物学活性高，可长期表达，有效弥补蛋白治疗的不足，同时降