增殖缺陷型腺病毒介导人内皮抑素基因抗乳腺癌的实验

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1、增殖缺陷型腺病毒介导人内皮抑素基因抗乳腺癌的实验【摘要】目的通过建立裸鼠乳腺癌肿瘤模型，在体内实验中进一步证实携带人内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒AdhE的抗肿瘤作用。方法在BALB/c裸鼠皮下种植人乳腺癌细胞MCF7，建立移植瘤模型。在瘤体内注射AdhE治疗，观察肿瘤生长，免疫组化检测肿瘤细胞内皮抑素的表达和计数肿瘤间质中微血管的数量。结果AdhE具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用，瘤体内注射重组腺病毒后4周，AdhE治疗组肿瘤体积为（225.3±90.2）mm3，明显小于AdLacZ病毒对照组（794.9±189.8）mm3和空白对照组（890.7±102.5）mm3。免疫组化显示

2、，乳腺癌细胞在感染腺病毒后能够有效表达内皮抑素，阳性细胞比率超过60％以上。AdhE治疗组瘤组织中血管数量（16.3±7.3）明显少于空白对照组（54.6±17.6）和AdLacZ病毒对照组（49.8±21.2）。结论增殖缺陷型腺病毒介导人内皮抑素的表达，具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用。【关键词】腺病毒内皮抑素乳腺癌基因治疗　　0引言　　近年来，抗肿瘤血管生成的基因治疗策略倍受关注［1］，已发现的多种具有抑制肿瘤血管生成的活性物质中以血管抑素和内皮抑素最为引人注意［2，3］。前期我们构建了携带人内皮抑素基因（humanendostatin，hE）的增殖缺陷型腺病毒AdhE，并在体外细胞学

3、实验中证实AdhE感染乳腺癌细胞株MDAMB231和MCF7后，可介导内皮抑素基因的高效表达，且表达的内皮抑素可明显抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞的生长［4］。在此基础上，本文通过建立裸鼠乳腺癌模型，开展体内实验进一步证实AdhE的抗肿瘤作用。　　1材料与方法　　1.1材料来源　　携带人内皮抑素基因（Humanendostatin,hE）的增殖缺陷型腺病毒AdhE和携带报告基因LacZ的增殖缺陷型腺病毒AdLacZ由我们自己构建并保存，人乳腺癌细胞株MCF7购于美国ATCC细胞库，鼠抗人hE单克隆抗体、鼠抗人CD31单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术公司

4、。　　1.2肿瘤模型的建立　　5周龄BALB/c裸鼠30只，雌雄各半，中科院上海实验动物中心提供。取对数生长期的MCF7细胞，用PBS液调整细胞数至1×108/ml，按100μl／只接种于裸鼠乳房脂肪垫，恒温、通风、无菌条件下饲养。每日定时观察瘤体生长情况，当接种区皮下出现米粒至黄豆大小硬结，即为种植成功。　　1.3病毒治疗　　将成瘤的裸鼠随机分为3组（AdhE组、AdLacZ组、空白对照组），每组10只，称重，编号。以1×108pfu/100μl的重组病毒（AdhE组、AdLacZ组）直接瘤内多点注射，隔日一次，共10次，总剂量1×109pfu／只。空白对照组以病毒保存液AdBuf

5、fer（10mmol/LTrisHClpH8.0，2mmol/LMgCl2，4%Sucrose）代替重组病毒同步注射，100μl×10次。定时测量瘤体生长情况，以“a×b2×0.5”公式计算瘤体体积（a为最大径，b为最小径）。　　1.4病理检查　　治疗后观察一个月，断颈处死小鼠，取瘤体标本，在PBS液中漂洗干净，以10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚4μm，常规HE染色，观察肿瘤治疗后的变化情况。采用SP法进行hE表达和CD31血管标记的免疫组化染色。以PBS替代一抗作为阴性对照。HE染色以背景清亮、胞核或胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性染色，每例随机计数5个高倍视野，阳性细胞数在10％以

6、内为（－），大于10％为（＋）。CD31染色以纹理清晰的血管着色为一个计数单位，随机选择5个高倍视野，计数血管密度（MVD）。　　1.5统计学处理　　所有数据采用SPSS11.5分析软件进行统计学处理，以±s表示，均数比较采用Student’sttest，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。　　2结果　　2.1AdhE对裸鼠乳腺癌移植瘤生长的影响　　BALB/c裸鼠接种人乳腺癌细胞MCF7后约20d成瘤，当直径达5mm左右开始治疗。自首次治疗至28d，肿瘤体积变化，见图1，AdhE治疗组肿瘤体积为（225.3±90.2）mm3，而AdLacZ病毒对照组为（

7、794.9±189.8）mm3，空白对照组为（890.7±102.5）mm3。与空白对照组相比，AdhE治疗组已收到明显疗效，两组间存在显著性差异（P＜0.01）。而携带报告基因的对照病毒AdLacZ组与空白对照组相比无明显差异（P＞0.05）。　　图1携带人内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒AdhE抗乳腺癌的动物实验（略）　　2.2病理检查结果　　瘤组织病理切片，常规HE染色可见空白对照组和A