超声破坏微泡介导内皮抑素基因治疗肝癌及其机制研究

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1、重庆医科大学博士学位论文超声破坏微泡介导内皮抑素基因治疗肝癌及其机制研究姓名：李攀申请学位级别：博士专业：影像医学与核医学指导教师：王志刚201205超声破坏微泡介导内皮抑素基因治疗肝癌及其机制研究摘要第一部分携内皮抑素脂质基因超声微泡的制备第一节重组人内皮抑素质粒载体的构建、纯化及鉴定目的构建重组人内皮抑素真核表达载体并制备脂质超声微泡携带目的基因。方法根据目的基因片段设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增并纯化，然后将纯化的目的基因与pEZ—M46载体分别酶切并进行连接，构建内皮抑素基因重组真核表达载体pEZ．

2、M46一ES，并转化至大肠肝菌，进行菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定重组克隆。结果经双酶切电泳和DNA测序分析证实，重组克隆载体内的目的基因片段序列与GENEBANK上报道的Endostatin基因序列基本一致，编码蛋白质的氨基酸序列完全相同。结论成功构建了人重组内皮抑素基因质粒载体。第二节微泡基因载体的制备及基本特性检测目的研制性能稳定、高效的微泡类基因载体以携带目的基因。方法采用成膜水化法、膜挤压法和机械振荡法分别制备脂质超声微泡和纳米脂质体，通过生物素一亲和素法将微泡一纳米脂质体连接起来，以构建载基因量高的微泡类

3、载体；在配方中加入带正电荷的成膜材料DC．胆固4醇(DC．cholester01)，通过机械振荡法制备阳离子脂质超声微泡，光镜下观察微泡形态，并对其体外基本特性(浓度、粒径、表面电荷)、增强超声显像效果、载基因特性等进行考察。结果光镜下显示，纳米脂质体被成功连接到了脂质微泡表面，然而其连接效率差，浓度过低；成功制备了阳离子脂质超声微泡，微泡表面形态规整，大小均一，分散度好，其浓度、粒径及表面电荷分别为3．13+0．26>(109／ml，1．6+0．299m，21．07+5．30mV。在造影模式下，能显著增强兔肝脏超声显像，

4、持续时间长。普通微泡带负电荷或不带电荷，携带基因能力低，而阳离子微泡携带较多正电荷，载基因量显著增加。两者的基因结合率分别为4．334-1．47％并H31．45+5．16％。结论纳米脂质体．超声微泡复合物不符合超声造影剂要求，无法作为基因载体携带目的基因联合超声进行下一步的靶向治疗研究；阳离子脂质超声微泡具备超声造影剂的基本特性，并可成为一种高效的基因载体。第二部分超声破坏阳离子微泡介导内皮抑素基因体外细胞转染实验第一节超声破坏微泡介导内皮抑素基因转染对脐静脉内皮细胞生长和血管形成的影响目的探索超声破坏微泡介导基因治疗的最

5、佳声学条件，然后以阳离子微泡作为基因载体，联合超声介导内皮抑素基因转染脐静脉内皮细胞(HUVEC)，研究其对细胞生长和血管形成的抑制作用。方法将5重庆医科大学帽士研宄生学位论文pEZ．M46一ES质粒转化大肠杆菌，采用质粒抽提试剂盒扩增纯化质粒，调整质粒浓度为0．1u∥¨l进行转染。收集对数生长期人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，首先采用不同强度超声进行分组处理，分别为：0．1、0．2、O．3、0．5W／cm2，然后将超声强度固定为0．1W／cm2，加入不同浓度微泡后联合处理，微泡浓度分别为：1、3、5、7×108／ml，根

6、据细胞存活情况筛选出最佳超声强度和微泡浓度组合，然后按以下分组对细胞进行处理：①空白对照组(C)，②质粒+脂质体组(P+L)，⑧质粒+超声辐照组(P+US)，④质粒邯日离子微泡组(P+US)，⑤质粒邯日离子微泡+超声辐照组(P+MB++US)。①组以空质粒作为阴性对照，②组以脂质体2000介导基因转染作为阳性对照，③组观察单独超声基因转染的影响，④组观察单独阳离子微泡介导基因转染的效果，⑤组测试超声破坏阳离子微泡介导内皮抑素基因转染的效果。对各组细胞进行处理后24h，(1)在倒置荧光显微镜下观察转染情况，并收集细胞采用流式

7、细胞术检测转染效率；以MTT法观察各组细胞生长情况，计算抑制率；(2)Westernblot法检测各组细胞中Endostatin的表达情况。(3)将HUVEC细胞接种至预先铺好Matrigel的Ttranswell，建立体外人造微血管模型，同上进行分组处理，24h后进行固定、染色，观察血管网的形成数量。结果超声强度为0．1和O．2W／cm2时，细胞存活率未受明显影响，达No．3W／cm2时，细胞存活率出现一定程度降低，达No．5W／cm2时，细胞存活率急剧下降。超声强度固定为0．1W／cm2，微泡浓度为7×108／ml时，

8、细胞存活率轻度降低。分组转染pEZ—M46一ES质粒后，倒置荧光显微镜下可观察P+Ⅷ+US组禾JP+L组均有大量细胞发出绿色荧光，P+US6重庆医科大学博士研充生学位论文组$IIP+MB组仅少数细胞表达荧光，流式细胞术检测转染率各实验组分别为：31．24+8．3％，12．57+0．67％，3．14+0．