超声介导微泡空化促基因转染内皮细胞机制初探

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1、南方医科大学硕士学位论文超声介导微泡空化促基因转染内皮细胞机制初探姓名：王玉筵申请学位级别：硕士专业：老年医学（心血管）指导教师：吴赛珠20080415中文摘要进入临床并进行初步实践；如开胸心肌注射VEGFl2l重组腺病毒、经心内膜和心包注射重组VEGFl65和VEGFl2l真核表达质粒、冠脉内注射bFGF、VEGFl65进行血运重建的临床试验等。这些研究虽然取得了一些令人振奋的效果，但有创、高风险的基因传输方式明显限制了分子搭桥疗法的深入开展。超声在基因和活性药物靶向传输中的应用是正在兴起的研究热点，其核心是应用超声波及声学造影剂微气泡发展基因和药物定向传输及释放

2、技术，即超声介导微泡空化靶向传输系统。该系统的原理是将声学造影剂微气泡耦连或包载靶向药物或基因，使载药微泡在显影心肌的同时，利用声学造影剂微气泡在超声场内发生的空化效应，将基因和药物运载和释放到特定的组织和器官，使局部组织达到有效的治疗浓度。已有充分研究证实该系统的可行性和应用前景，其全身给药少、局部浓度高、无创、简便、并可在床边进行等优点，给予当前靶向性差、正处于低迷状态的基因疗法以新的希望。【目的】本研究拟在DNA转染过程中，利用分子生物学、细胞生物学、DNA免疫荧光标记技术和声学影像技术，观察超声波、微泡空化报告基因转染内皮细胞的增强作用；探讨超声波、微泡空化

3、对内皮细胞膜的流动性、细胞骨架生物作用，试图初步阐明超声介导微泡空化促进内皮细胞基因转染的细胞和分子机制，探索超声介导微泡空化转染基因的优化条件，为超声介导微泡空化靶向心肌传输治疗基因的“分子搭桥”提供理论依据和实践指导。【材料与方法】l、研究对象及分组成功取材大鼠肺微血管内皮细胞，实验过程中6孔板培养细胞，待细胞处于对数生长期分别转染与白蛋白微泡孵育的报告基因eGFP质粒，对不同组别的细胞发射超声，并进行定量分析报告基因的表达效率，探讨靶向微泡的基因传输功能；不同条件下超声照射大鼠肺微血管内皮细胞后，分别对细胞骨架微丝、微管行免疫荧光染色，荧光显微镜下观察细胞形态

4、及应用软件Simplepcr测量荧硕士学位论文光强度并进行分析；免疫组化法NBD．C6．HPC探针行细胞膜染色，激光共聚焦显微镜观察应用FRAP技术间接测量不同条件下细胞膜流动性、荧光恢复率的变化，探讨细胞膜流动性的改变与细胞转染率之间的关系。2、试验仪器及设备全氟显(南方医科大学大学药学部研制)；超声影像系统Sequoia512(美国Acuson公司)；质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司(德国)；DHs。工程菌(本校组织工程与构建实验室赠)；eGFP质粒(美国lnvitrogen公司)；兔抗鼠微管蛋白一抗(美国LabVision公司)：羊抗兔二抗(美国KPL公司)

5、；倒置荧光显微镜IX71(日本Olympus公司)，Simplepei荧光分析软件(美国)；NBD—C6-HPC探针(美国MoleculeProbe公司)；牛血清白蛋白等。3、试验方法(1)超声介导微泡空化靶向传输细胞模型的制备；取全氟显(全氟丙烷人血白蛋白微泡注射剂，南方医科大学药学部)冻干制剂1支，用3mL生理盐水溶解，轻摇至混浊，4℃静置2h。弃少许上层泡沫：悬浊液，加入质粒eGFP至终浓度为100me：／ml，置4℃冰箱2h。培养板中每孔换入含1％FBS的RPMI．1640培养基1．8ml，一组加入200rtl微泡质粒混合液另一组加入200ml微泡。超声照射

6、24h后荧光显微镜下观察。(2)报告基因eGFP的大量制备；复苏大肠杆菌DH5a，常规摇菌扩增，将报告质粒eGFP．e2按氯化钙法转入细菌，蓝、白菌落筛选法挑选阳性克隆菌落；大量扩增转化细菌，按试剂盒说明书要求提取质粒，Biophotometer生物分光光度计测质粒浓度为300I．tg／mL，调整质粒浓度为1mg／mL。(3)大鼠肺微血管内皮细胞的取材及培养；SD大鼠(南方医科大学实验动物中心，SPF级)，质量130"--"150g。无菌条件下取肺的边缘，差速生长分离法去除平滑肌细胞，待内皮细胞纯度达95％以上用于实验。细胞生长至第三代，传代于6孔板中，处于对数生长

7、期时用于实验。中文摘要(4)超声介导微泡空化对大鼠肺微血管内皮细胞细胞骨架的影响；超声照射后，免疫组化染色微管、微丝蛋白，倒置荧光显微镜IX71(Olympus，日本)检测并采集荧光图像，Simplepcr(美国)计数细胞并进行荧光强度分析。(5)超声介导微泡空化对细胞膜流动性的影响；共聚焦专用培养皿中的细胞超声照射后，不同条件超声照射后探针NBD．C6．HPC标记细胞膜，应用激光共聚焦显微镜上的flap程序间接测定细胞膜流动性。【结果】1．顺利完成大鼠肺微血管内皮细胞的原代取材及纯化；成功建立超声介导微泡空化靶向传输细胞模型。2．利用超声介导微泡空化靶向传输系