人内皮抑素小环载体的构建及其在真核细胞中的表达

《人内皮抑素小环载体的构建及其在真核细胞中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、第27卷第3S期2006年6月Vol.27No.3SJun.2006中山大学学报(医学科学版)JOURNALOFSUNYAT-SENUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES)人内皮抑素小环载体的构建及其在真核细胞中的表达徐本玲*，吴江習S薛刚2,赵鹏'•肖林'，黄必军S黄文林,(1.华南肿瘤学国家重点实验室〃中山大学肿瘤防治中心，广东广州510060；2.成都军区总医院，普外科，四川成都610083)摘要目的】构建表达人内皮抑素的小环DNA载体与普通质粒，并观察其在真核细胞中的表达。【方法】从pedNA3.l(+)中扩增Pcmv和BGHpolyA片段，定

2、向克隆于pSP72质粒中，构建成pSP72-Pcmv-BCHpolyA0将从pSP72-hEndo-sUtin-IRES-ECFP质粒中■切得到的hEndostatin-IRES-EGFP分别克隆到pSP72-Pcmv-BGHpolyA和pcDNA3.1(+),构建成pSP72-Pcmv-hEnd(»iatin-IRES-EGFP-BGHpolyA(pSP72-hES)和pcDNA3.1-hEnd(»tetin-IRES-EGFP(pcDNA-hES)o对质粒PSP72-hES和pvC31分别做双靜切，体外连接，构建成fxp-hESo艸-hES转化TOP10细菌后，

3、通过介导分子内亶组，降解细菌骨架，荻取只含目的基因表达盒的小环DNA载体mc-hESo将mc-hES,p

4、：小环DNA载体；内皮抑索｝增强的绿色荧光蛋白；非病毎载体；质粒中图分类号:R73；Q81文Itt标识码：A文章编码：1672-3554(2006)3S-0017-04收稿日期：2006-12-15基金项目：“973"计划项目(2004CB518801)；博士后基金(2004036156)作者简介：徐本玲(1977-),女，河南新乡人，硕士生；黄文林，教授，课题负责人，通讯作.E-mail:wlJiuang@hotmail.com抗肿瘤血管生成治疗成为一种新的肿瘤治疗策略。内皮抑X(endostatin)被认为是目前最具潜力的抗血管生成物之一，具有显著抑制内皮细胞生

5、长和抗血管生成的作用。国内外许多学者采用腺病毒载体，逆转录病毒载体，腺病毒相关病毒载体携带内皮抑素进行基因治疗，内皮抑累对多种实体瘤的生长和转移都能产生抑制作用卩“。我们构建一种新型的非病毒载体-小环DNA载体mc-hES,分析其和p

6、hol、XbaI、SacI、EcoRI、BgiII、Sall、NheI、Spe,购自PROMEGA公司。大肠杆菌ToplO为北京天为时代公司产品。CNE2(人鼻咽癌)细胞为本室保存。Trizol和逆转录RT试剂盒为Promega公司产品。hEndostatin单克隆抗体(sc—32720)为SantaCruzBiotechnology公司产品。1.2Pcmv和BGHpolyA的扩增从pcDNA3.1(+)上通过PCR法分别获得Pcmv和BGHpolyA片段。Pcmv上游引物:5'ccggaattcgctagccgcgttgacattgattattgaetag3'

7、含EcoRI、NheI酶切位点，下游引物:5'cgcggatccagagetetgettatatagacctecc3'含BamHI酶切位点(扩增长度615bp)oPCR反应条件为94X5min,941min58X1min72X.lmin共30个循环，72*€10min,4弋终止反应。BGHpolyA上游引物:5'gcctetagagtc-gacactgtgeeltelagttgccagccat3'含Xbal、Sal酶切位点，下游引物:5'atactcgaggeeatagagcccaccgcateeccag3r,含Xhom切位点(扩增长度251bp)oPCR反