鼠血管抑素angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达论文

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1、鼠血管抑素Angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达论文.freelorangiogenesisAbstract:AIMToconstructangiostatincDNAeukaryoticexpressionplasmid，transfecthumangastrictumorcellsSCG7901，andidentifytheexpressionofangiostatin.METH┐ODSAngiostatincDNA（plasminogenk1-k3idpcDNA3.1（+）.Genetransfer

2、intogastrictu-morcellsSGC7901e（TfxTM），ac-cordingtothetransfectionprotocolinthemanual.ThenthroughG418screening，stableresistantclonestheexpressionofangiostatininselectedclones.RESULTSTheconstructedplasmidpcDNA3.1（+）-angiostatinedaticdigestionandgenesequenc-ing.arkers（华美

3、生物工程公司）;PlusMilipreDNA纯化kit（Promega）.细菌菌株DH5α，为本研究所保存.质粒pRC-angiostatin:含位于HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点间的1.4kb的an-giostatincDNA片段，angiostatin碱基序列.质粒pcDNA3.1（+）:本实验室保存，含启动子T7位于多克隆位点前，复制起始点SV40ori，抗氨苄青霉素及G418基因.人胃癌细胞株SCG7901由本实验室保存.兔抗HAtag多克隆抗体由本室张德新博士惠赠;辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗、-Regent20（Pro

4、mega）.1.2方法所用常规方法参照《现代分子生物学试验手册》和《分子克隆》.1.2.1真核表达载体pcDNA3.1（+）-angiostatin的构建流程示意图（Fig1（略））.1.2.2质粒的制备及鉴定氯化铷法制备感受态细菌DH5;质粒pRC-angiostatin，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1（+）-angiostatin转化宿主菌，筛选氨苄抗性克隆;参照PlusMilipreDNA纯化kit操作说明制备纯化质粒DNA，测定A260和A280值，测定纯度和含量;分别用HindⅢ，HindⅢ+XbaⅠ，BamH

5、Ⅰ酶切鉴定，琼制糖凝胶电泳分析;用Sanger双脱氧终止法测序检测angiostatincDNA基因序列，判断是否与应具有的碱基序列相符（Fig2）.1.2.3血管抑素基因片段的纯化酶切反应体系50μL，包含:载体pRC-angiostatin2μg，HindⅢ内切酶2.5μL，XbaⅠ内切酶2.5μL，10×Buffer5μL，37℃水浴2h;酶切产物经10gL-1琼脂糖60V电泳1h，EB染色，紫外透射下观察分析，回收HindⅢ+XbalⅠ酶切释放片段并纯化，参照核酸片段回收试剂盒（Promega）说明操作.1.2.4真核表达

6、载体的构建连接反应体系20μL，包含:从凝胶上回收纯化的angiostatincDNA基因片段0.3μg，载体pcDNA3.1（+）0.5μg，连接酶1μL，4℃过夜;重组质粒转化宿主菌，克隆筛选，提取质粒和鉴定，操作方法如前.1.2.5G418筛选浓度的确定在24孔板中每孔加入2×104SCG7901细胞/G418（100-1000）mgL-1，培养14d，并观察细胞生长状况，将12d细胞全部死亡所需的最低药物浓度确定位筛选浓度.1.2.6胃癌细胞株SCG7901的转染和筛选950mLL-1乙醇沉淀构建的pcDNA3.1（+）-

7、angio-statin，pcDNA3.1（+），用无菌去离子水重新溶解沉淀，测定含量.按Promega公司的脂质体转染操作说明转染真核细胞:在无菌条件下配制1mL无血清RP1640培养液含质粒DNA2μg，TfxTM10μL，试验组TfXTM/pcDNA3.1（+）-angiostatin，对照组TfXTM/pcDNA3.1（+），空白对照组TfXTM，混合后置室温下反应30min，形成DNA-质脂体复合物;对数生长期细胞2×105个加入2mL6孔板中，培养至80%融合，用无血清培养液RP1640洗涤细胞，待转染;滴加复合物到细

8、胞中，培养1h，更换为含150mLL-1FBS的RP1640培养液继续培养48～72h;48h后按15稀释转染细胞，用含筛选浓度的G418培养液培养4gL-1G418培养液扩大培养，镜下观察.1.2.7r38000，与预计结果相符（Fig6，7（略