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时间:2018-11-20
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1、鼠血管抑素Angiostating真核表达载体的构建及在人胃癌细胞中的表达论文.freelorangiogenesisAbstract:AIMToconstructangiostatincDNAeukaryoticexpressionplasmid,transfecthumangastrictumorcellsSCG7901,andidentifytheexpressionofangiostatin.METH┐ODSAngiostatincDNA(plasminogenk1-k3idpcDNA3.1(+).Genetransfer
2、intogastrictu-morcellsSGC7901e(TfxTM),ac-cordingtothetransfectionprotocolinthemanual.ThenthroughG418screening,stableresistantclonestheexpressionofangiostatininselectedclones.RESULTSTheconstructedplasmidpcDNA3.1(+)-angiostatinedaticdigestionandgenesequenc-ing.arkers(华美
3、生物工程公司);PlusMilipreDNA纯化kit(Promega).细菌菌株DH5α,为本研究所保存.质粒pRC-angiostatin:含位于HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点间的1.4kb的an-giostatincDNA片段,angiostatin碱基序列.质粒pcDNA3.1(+):本实验室保存,含启动子T7位于多克隆位点前,复制起始点SV40ori,抗氨苄青霉素及G418基因.人胃癌细胞株SCG7901由本实验室保存.兔抗HAtag多克隆抗体由本室张德新博士惠赠;辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗、-Regent20(Pro
4、mega).1.2方法所用常规方法参照《现代分子生物学试验手册》和《分子克隆》.1.2.1真核表达载体pcDNA3.1(+)-angiostatin的构建流程示意图(Fig1(略)).1.2.2质粒的制备及鉴定氯化铷法制备感受态细菌DH5;质粒pRC-angiostatin,pcDNA3.1(+),pcDNA3.1(+)-angiostatin转化宿主菌,筛选氨苄抗性克隆;参照PlusMilipreDNA纯化kit操作说明制备纯化质粒DNA,测定A260和A280值,测定纯度和含量;分别用HindⅢ,HindⅢ+XbaⅠ,BamH
5、Ⅰ酶切鉴定,琼制糖凝胶电泳分析;用Sanger双脱氧终止法测序检测angiostatincDNA基因序列,判断是否与应具有的碱基序列相符(Fig2).1.2.3血管抑素基因片段的纯化酶切反应体系50μL,包含:载体pRC-angiostatin2μg,HindⅢ内切酶2.5μL,XbaⅠ内切酶2.5μL,10×Buffer5μL,37℃水浴2h;酶切产物经10gL-1琼脂糖60V电泳1h,EB染色,紫外透射下观察分析,回收HindⅢ+XbalⅠ酶切释放片段并纯化,参照核酸片段回收试剂盒(Promega)说明操作.1.2.4真核表达
6、载体的构建连接反应体系20μL,包含:从凝胶上回收纯化的angiostatincDNA基因片段0.3μg,载体pcDNA3.1(+)0.5μg,连接酶1μL,4℃过夜;重组质粒转化宿主菌,克隆筛选,提取质粒和鉴定,操作方法如前.1.2.5G418筛选浓度的确定在24孔板中每孔加入2×104SCG7901细胞/G418(100-1000)mgL-1,培养14d,并观察细胞生长状况,将12d细胞全部死亡所需的最低药物浓度确定位筛选浓度.1.2.6胃癌细胞株SCG7901的转染和筛选950mLL-1乙醇沉淀构建的pcDNA3.1(+)-
7、angio-statin,pcDNA3.1(+),用无菌去离子水重新溶解沉淀,测定含量.按Promega公司的脂质体转染操作说明转染真核细胞:在无菌条件下配制1mL无血清RP1640培养液含质粒DNA2μg,TfxTM10μL,试验组TfXTM/pcDNA3.1(+)-angiostatin,对照组TfXTM/pcDNA3.1(+),空白对照组TfXTM,混合后置室温下反应30min,形成DNA-质脂体复合物;对数生长期细胞2×105个加入2mL6孔板中,培养至80%融合,用无血清培养液RP1640洗涤细胞,待转染;滴加复合物到细
8、胞中,培养1h,更换为含150mLL-1FBS的RP1640培养液继续培养48~72h;48h后按15稀释转染细胞,用含筛选浓度的G418培养液培养4gL-1G418培养液扩大培养,镜下观察.1.2.7r38000,与预计结果相符(Fig6,7(略
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