大鼠eaat3真核表达载体的构建及在hella细胞中的表达论文

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1、大鼠EAAT3真核表达载体的构建及在Hella细胞中的表达论文晁晓东,费舟,张磊,李娟,仝武军【摘要】目的：克隆大鼠谷氨酸转运蛋白3（EAAT3）的cDNA，构建其真核表达载体并转染Hella细胞.方法：从大鼠的脑组织中提取RNA,采用RTPCR技术扩增EAAT3的基因编码区序列,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经酶切及测序鉴定后用阳离子脂质体将其转染到Hella细胞中，通过免疫印迹法鉴定其表达.结果:经双酶切、测序鉴定证实EAAT3基因的真核表达载体构建成功.免疫印迹法证实EAAT3基因的表达.结论:成功克隆了EA

2、AT3编码区序列,并构建了其真核表达载体,为以EAAT3为基础的中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础.【关键词】载体蛋白质类;谷氨酸;真核表达载体0引言通常认为，细胞外液中没有使谷氨酸（Glu）失活的水解酶系统.对从神经末梢释放出来的Glu的清除和失活的唯一途径是通过位于突触前膜和神经胶质细胞膜上的兴奋性氨基酸转运体(EAAT)的摄取而实现［1］.目前，已克隆了5种EAAT［2］，分别是EAAT1，EAAT2，EAAT3.freelega公司）；Trizol及lipofection2000（Invitrogen公司）；QuantscriptR

3、TKitcDNA第一链合成试剂盒、TaqPlusDNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒及DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）；限制性内切酶XhoⅠ，EcoRI及T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；EAAT3抗体（美国Santacruz公司）；其它试剂为进口或国产分析纯试剂.1.2方法1.2.1脑组织RNA的提取用10g/L戊巴比妥钠按20mg/kg静脉麻醉大鼠，断头取全脑，-70℃保存.取-70℃冻存的脑组织100mg，加入预冷至4℃的TrizolReagent1mL裂解细胞，用2mL匀浆器匀浆，静置10min后将裂解产物转移至微量离心管

4、中，加1mL氯仿，振荡15s，室温静置2～3min，4℃，12000g离心15min.取上清液移入新的微量离心管，加异丙醇2.5mL，轻轻混匀，室温静置5～10min，4℃，12000g离心10min.弃上清，加入750mL/L乙醇1mL，洗涤沉淀物，4℃，7500g离心5min.弃上清，将沉淀物在真空中干燥5～10min.用DEPC水15μL溶解沉淀，-70℃保存.取待测样品2μL，紫外分光光度计比色法定量分析RNA含量.RNA实验过程中，所有实验用品均经DEPC处理，灭活RNA酶.1.2.2引物设计根据GenBank中已报道的大鼠EA

5、AT3cDNA(X94255)的基因序列设计合成大鼠EAAT3引物,上游引物:5′GAATTCGCCACCATGGGGAAGCCCACGAGCT3′,设有EcoRI酶切位点，下游引物5′CTCGAGCTAGAACTGCGAGGTCTGAGTGAAC3′设有XhoⅠ酶切位点.1.2.3RTPCR扩增大鼠EAAT3cDNA根据TIANGEN公司试剂盒说明，用随机引物反转录获得EAAT3cDNA后进行PCR扩增.反应条件为预变性94℃5min,94℃30s，61℃30s，72℃90s，30个循环，72℃延伸10min.将PCR产物5μL在含溴

6、化乙锭的10mL/L琼脂糖凝胶电泳,.freelageMaster9.VDS电泳成像装置观察结果并拍照.1.2.4目的基因克隆和酶切鉴定将PCR回收产物与pGEMT载体于16℃连接过夜，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在铺有IPTG及XβGal的氨苄青霉素琼脂糖平板上进行蓝白菌落筛选,挑取白色阳性菌落,37℃过夜培养菌体.取菌液,提取质粒DNA,用EcoRI,XhoⅠ双酶切.观察EAAT3片段是否已克隆到pGEMT载体中.1.2.5DNA序列测定挑选酶切鉴定正确的重组菌pGEMT/EAAT3,以重组质粒DNA为测序模板,由上海

7、捷瑞生物技术公司测序.并用Sequence3.0分析软件对测序结果与GenBank中的数据进行分析.1.2.6大鼠EAAT2真核表达载体的构建将带有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的pGEMT/EAAT3双酶切,纯化回收酶切片段,同样对pcDNA3.1(+)载体进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切纯化回收,完全酶切后将pcDNA3.1(+)载体和EAAT3片段用T4DNA连接酶连接过夜,构建大鼠EAAT3真核表达载体pcDNA3.1(+)/EAAT3,将连接物转化大肠杆菌TOP10,用Amp抗性筛选阳性克隆，提取质粒DNA.用EcoRI,XhoⅠ

8、双酶切、PCR方法鉴定所筛选的阳性克隆.将所克隆片段的序列在NCBI/GenBank数据库进行Blast比对和分析.1.2.7转染Hella细胞将Hella细胞常规培养于含100mL/L小牛血