大鼠微小RNA-22腺病毒载体的构建和鉴定-论文.pdf

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1、中华老年心脑血管病杂志20L4年8月第16卷第8期ChinJGeriatrIteartBrainVesselDis，Aug2014，Vol16，No．8·853·．基础研究大鼠微小RNA一22腺病毒载体的构建和鉴定范致星，杨简，杨俊，丁家望，彭家芹，杨超君摘要：目的构建并鉴定大鼠miR一22腺病毒栽体，制备具有一定滴度含miR一22基因的重组腺病毒，为后期研究miR一22在心肌缺血再灌注损伤中的作用及分子机制奠定基础。方法化学合成目的基因序列(含酶切位点)，对目的基因进行PCR扩增、酶切，酶切后的目的基因与酶切后的GV202载体连接产生miR一22腺病毒表达载体，

2、将连接好的产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞获得大量阳性克隆，对阳性克隆进行酶切鉴定及测序鉴定。利用脂质体2000试剂，让成功构建的miR22重组腺病毒载体和腺病毒包装质粒共转染人胚肾293细胞，得到重组腺病毒，完成重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定。结果成功构建了大鼠miR一22腺病毒载体。经重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定，最终获得的重组腺病毒滴度为1×10PFU／m

3、。结论成功构建帝】备获得了具有一定滴度含miR22基因的重组腺病毒，为后期顺利开展有关miR一22在心肌缺血再灌注损伤中的作用及分子机制研究提供了可能。关键词：腺病毒科；微RNAs；心肌再灌注损伤；质

4、粒；转染；脂质体ConstructionandidentificatiOn0fratmiR-22adenovirusvectorFANZhi—xing，YANGJian，YANGJun，etal(InstituteofCardiovascularDiseases，Department0厂Cardiology，FirstCollegeofClinicalMedicine，ThreeGorgesUniversity，Yichang443003，HubeiProvince，China)Abstract：ObjectiveToconstructandidentifythe

5、ratmiR一22adenovirusvectorforfurtherstud—yingtheroleofmiR22inmyocardialischemia／reperfusioninjuryanditsmolecularmechanism．MethodsTargetgenesequencesweresynthesized．ThemiR一22adenovirusvectorwasconstruc—tedbyamplifyinganddigestingthetargetgeneandlinkingthedigestedGV2O2vectortothetar—getg

6、ene．ThepositiveclonesachievedbytransfectingtheDH5acellsintotheconstructedvectorwereidentifiedbydigestingandsequencing，respectively'．Therecombinantadenoviruswithatiterof1×1O。PFU／m1obtainedbytransfectingtheHEK293cellsintotheconstructedmiR一22adeno—virusvectorandadenoviruspackageplasmidsw

7、ithLipofectin2000wasamplifiedandpuried．ResultsTheratmiR一22recombinantadenovirusvectorwithatiterof1×10。PFU／m1wassue—cessfullyconstructed．ConclusionThesuccessfullyconstructedmiR22recombinantadenovirusvectorcanbeusedinstudyingtheroleofmiR22inmyocardialischemia／reperfusioninjuryanditsmole

8、cularmechanism．Keywords：adenoviridae；microRNAs；myocardialreperfusioninjury；plasmids；transfection；lipo～SnmeS微小RNA(microRNA，miR)是一类长18～24明，许多细胞内外miR的改变与心肌梗死、心力衰个核苷酸的高度保守的非编码RNA，主要通过结合竭、心肌病和心律失常等心血管疾病相关J。近年mRNA3非翻译区调控翻译，并可微调细胞信号转有文献报道，miR在机体内含量的改变与心肌缺血导通路和细胞发育过程中的蛋白质Ⅲ。大量研究表再灌注损伤的发生、发展也有着

9、密切的关系