新型表达骨形态发生蛋白2腺病毒真核细胞载体的构建和鉴定

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1、新型表达骨形态发生蛋白2腺病毒真核细胞载体的构建和鉴定：张正，刘丹平，陈峻江，郭韬，张男【摘要】目的构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的骨形态发生蛋白2(BMP2)目的蛋白和报告分子绿色荧光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核细胞表达载体。方法将去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点XhoⅠ的BMP2基因定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV-IRES-hrGFP-1。携带BMP2+基因的重组腺病毒穿梭质粒经酶切鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1大肠杆菌，利用细菌内同源重组机制将BMP2+和GFP基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒。用Pac

2、Ⅰ酶切去除其质粒成分，暴露腺病毒基因组的反向末端重复序列，转染293细胞，进行腺病毒的包装，完成新型腺病毒载体AdCMV-BMP2+-IRES-GFP-1的构建。作为阳性对照，同时制备多年来广为应用的BMP2腺病毒表达载体AdCMV-BMP2。以两种载体感染骨髓基质细胞，通过RT-PCR和荧光显微镜分别检测骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白表达情况;通过碱性磷酸酶活性检测判断BMP2诱导成骨分化作用。结果突变后骨形态发生蛋白2基因序列、重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒质粒酶切图谱符合预定设计。感染骨髓基质细胞后，新型腺病毒载体可同时表达报告分子GFP和具有诱导成骨分化活性的BM

3、P2。结论成功构建表达BMP2的新型腺病毒载体。【关键词】骨形态发生蛋白2基因;绿色荧光蛋白;腺病毒载体;同源重组;成骨诱导Abstract:ObjectiveToconstructanovelrebinantadenovirusvectorexpressingtheBMP2fusedtoFLAGepitopeandgreenfluorescentprotein(GFP)asareporteronthesametranscript.MethodsThebasicpairsofBMP2behindthetranslationstoppingcodonTAGovedandaX

4、hoⅠrestrictionsiteutant.Then,themutantofBMP2gene(BMP2+gene)ultiplecloningsitesoftheadenovirusshuttleplasmidpShuttleCMV-IRES-hrGFP-1bymeansofthedirectionalcloningtechnology.Oncetestedbyrestrictiondigestion,theshuttleplasmideIandtransformedintoBJ5183-AD-1cellstorebinethegenesofBMP2+andGFPto

5、getherentsintoadenoviralplasmidthroughaneplifiedbacterialhomologousrebinantmethod.Toexposeitsinverstedterminalrepeats,therebinantadenoviralplasmidsarroalcells(MSCs),theexpressionofBMP-2geneedbyalkalinephosphataseactivityassay,andtheexpressionofGFPgeneicroscope.Asapositivecontrast,anotherr

6、ebinantadenovirus,AdCMV-BMP2,anyyearsago,utantortherestrictionmapsoftherebinantadenoviralshuttleplasmidsandtherebinantadenoviralplasmidsaccordedentalprojectbeforehand.Theneetime.TheexpressedBMP2hadosteoinductionactivity.ConclusionsAnovelrebinantadenovirusvectorexpressingtheBMP2fusedtoFLAG

7、epitopeandgreenfluorescentproteinasareporteronthesametranscriptorphogeicprotein2(BMP2)gene;greenfluorescentprotein(GFP);adenovirusvector;homologousrebination;osteoinduction　　重组腺病毒在基因治疗中被作为一种高效基因转移和表达载体，广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞[1]。骨形态发生蛋白2(bonemorphogeicprotein2,BMP-2)是一种重要