人ctla-4ig腺病毒载体的构建鉴定与表达

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1、人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达作者：冯宁翰　张炜　吴军　眭元庚　钱立新　华立新　贺伟峰　宋宁宏　吴宏飞【关键词】CTLA-4Ig　　摘要：目的：运用PAdEasy系统构建了带荧光蛋白的人CTLA-4Ig腺病毒载体，为进一步研究CTLA-4Ig诱导免疫耐受的机制奠定了基础。方法：采用基因技术，将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中，利用PAdEasy系统进行重组，然后在293细胞中进行扩增。并进行病毒滴度测定。体外感染人肾小管上皮细胞。结果：酶切鉴定和PCR证明重组人CTLA-4Ig腺病毒载体构建正

2、确。结论：应用PAdEasy细菌内重组技术成功构建了人CTLA-4Ig带荧光腺病毒载体。　　关键词：腺病毒;CTLA-4Ig;同源重组　　　TheExpressandRecombinantofAdenovirusofHumanCTLA-4IgGene　　Abstract:Objective:ToconstructtherecombinantadenovirusofhumanCTLA-4Iggene.Method:TheCTLA-4Iggenewas10clonedintotheshuttleplasmidpAdTrack-

3、CMVtoformthetransfervectorbythemethodofhomogenousrecombination.Result:ItisconfirmedthattheCTLA-4IggenewereinsertedsuccessfullyintotheadenovirusbyusingrestrictionendonucleaseandPCRanalyses.Conclusion:TherecombinantadenovirusofhumanCTLA-4Iggenewassuccessfullyconstru

4、cted.　　Keywords:Adenovirus；CTLA-4；Homogenicreconstruction　　器官移植是治疗许多终末期疾病的唯一有效方法。但移植后的排斥反应是影响移植物功能与存活的最大的障碍。现代研究表明，T细胞的活化是引起急性排斥反应的最主要因素。CD28/CTLA-4-B7是T细胞活化中重要的共刺激通道。阻断B7与CD28的结合，可以使移植物生存时间延长。CTLA-4存在于活化的T表面，是一种负调性的因子。它可以竞争性的阻断B7-CD28通路［1］。我们应用PAdEasy系统，构建了带荧光的CT

5、LA-4Ig腺病毒载体，为研究B7-CD28在诱导免疫耐受中的作用奠定了良好的基础。　　1材料和方法　　1.110材料：质粒和菌种：人CTLA4-Ig质粒由第三军医大学烧伤研究所保存，BJ5183菌株，Adeasier-1细胞，含绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein,GFP）的穿梭质粒pAdTrack-CMV,腺病毒基因组质粒PAdEasy-1购自美国Stratagene公司。293细胞购自美国ATCC公司。　　1.2试剂：Hidiii,XbaI,限制性内切酶，T4Ligase，TaqDNA聚合酶，

6、DNA回收试剂盒购自Takara公司，质粒DNA提取盒购自Omiga公司，DMEM购自Hyclone公司，PCR试剂盒为Promega公司产品，PCR引物由上海生物化学工程公司合成。　　1.3腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-CTLA4-Ig的构建：腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV和CTLA4-Ig分别进行酶切提取DNA。用Hidiii单切pAdTrack-CMV后，再用XbaI酶切。Hidiii和XbaI酶双切pCTLA4-Ig质粒,通过0.8%的琼脂电泳，分别回收pAdTrack-CMV和CTLA4-Ig的

7、片段，两者的分子量分别为9.2Kb和1.4Kb。用T4Ligase酶连接两者。钙转化大肠杆菌DH5α，挑选转化菌落，PCR筛选，提取质粒。酶切鉴定。　　1.4重组腺病毒质粒载体pAdEasy-1-CTLA4-Ig的构建与鉴定。取25ｕlpAdTrack-CMV-CTLA4-I用PmeI酶切线性化，然后去磷酸化，电转Adeasier-1细胞行同源重组（2500V，200Ohm,25ｕF）LB培养基37℃10培养60min，涂于卡那抗性板，过夜。手工提取转化菌落，根据电泳的质粒分子量，初步筛选出阳性重组体，再根据PCR和酶切鉴

8、定，提取阳性克隆。转至XL10-GOLD细菌，用PCR和酶切鉴定，正确。　　1.5重组腺病毒的包装和扩增：pAdEasy-1-CTLA4-Ig质粒DNA经酶切和酚-氯仿抽提后，经酶切，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀后，用脂质体2000转染293细胞。转染时，先用混合液滴加到漂洗过的293细胞中，6h后换成完全培