shrna表达载体pwh1的构建及用于hif1基因的沉默

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1、shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默：吴元明,张晓楠,韩者艺,李春英,陈南春【摘要】　　目的:构建用于RNAi的shRNA（smallhairpinRNA）表达载体及检测其对低氧诱导因子1（HypoxiainducibleFactor1,HIF1）基因的沉默效果。方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFPC1载体片段中,此载体命名为p:ToconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinRNA（shRNA）andtotestits

2、efficacyinsilencingtheHypoxiainducibleFactor1(HIF1)gene.METHODS:TheH1genepromoterplifiedfromthegenomeofthehumanbloodcellsbyPCR.Thenthepromotere.TheconstructedvectoredpluI双酶切,去掉pEGFPC1质粒上PCMV,EGFP,MCS和SV40polyA等片段,剩余的部分作为构建pluI之间加上一个接头DNA序列,该段接头DNA由下面2条引物退火形成（退火温度

3、:39.5℃）:序列1:5′TAATGGAATTCGAAGCTTA3′;序列2:5′CGCGTAAGCTTCGAATTCCAT3′。(2)通过PCR从人血细胞基因组DNA获得H1RNA基因Promoter[5]。取新鲜血液20mL,以1300r/min离心15min,取淡黄层细胞（白细胞）重悬于15mL抽提缓冲液（10mmol/LTrisClpH8.0,0.1mmol/LEDTApH8.0,20mg/L胰RNA酶,5g/LSDS）,37℃温育1h。加蛋白酶K至终浓度为100mg/L,温和混匀。50℃水浴中放置3h。冷却

4、至室温后,用等体积酚和氯仿抽提后,加入0.2体积10mol/L乙酸铵和2体积的乙醇,放置30min,12000r/min离心10min。700mL/L乙醇洗涤2次,空气中晾干。加入1mLTE(pH8.0)溶解DNA,此即人血细胞基因组DNA。以此DNA为模板,PCR引物为:P1:5′CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC3′(含EcoRI位点);P2:5′GCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC3′(含HindIII,BglII位点)。PCR产物通过EcoRI和

5、HindIII两个酶切位点克隆入pUC19质粒,进行序列验证。(3)pI1640培养液（含100mL/L小牛血清）在37℃、50mL/LCO2条件下培养。转染前24h将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板（瞬时）和24（稳定）孔板中,贴壁细胞在长满底面积80%时进行转染。转染按照LipofectamineTM2000试剂说明书操作。于转染后48h收集6孔板内细胞,做为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后72h按1∶10比例传代于60mm直径培养皿中,然后加入适量(400～1000mg/L)G418进行筛选,2周后挑取单个细胞集落,

6、扩大培养,然后做为稳定转染细胞表型鉴定用。(4)RTPCR检测HIF1基因的mRNA水平:待6孔板内细胞生长至底面积90%～95%时,收集细胞。参照Gibco公司TRIzol试剂使用方法提取细胞RNA,溶于20μLDEPC水内。用SuperScriptTMIIRTkit参照其使用说明进行cDNA第1条链的合成。人βactin内对照引物:P1:5′GGCCGGGACCTGACTGACTAC;P2:5′TCTTTGCGGATGTCCACGTC（长度331bp）。人HIF1RTPCR引物:P3:GATCTCGGCGAAG

7、TAAAGAATCTG;P4:AGAAAATTTCATATCCAGGCTGT（长度680bp）。PCR反应条件:95℃1min(94℃40s;56℃40s;72℃40s)×26cycle;72℃10min;4℃保存。(5):DNAmarkerDL2000;1:PCRofH1genepromoter.　　2.1.2重组质粒pUC19H1的酶切鉴定上述PCR产物经EcoRI和HindIII双酶切后,克隆入pUC19载体。阳性克隆命名为pUC19H1（图2）。pUC19H1质粒递交上海生工公司测序,结果显示,与GenBank

8、的H1基因启动子序列（登录号:X16612）完全一致。　　图2重组质粒pUC19H1的酶切鉴定结果（略）　　Fig2AGEanalysisofrebinantplasmidpUC19H1digestedwithEcoRIandHindIII　　图3pontgomeryMK