survivin特异性shrna表达载体的构建及评价

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1、Survivin特异性shRNA表达载体的构建及评价【摘要】目的构建针对人结肠癌细胞系Lovo的高效率沉默Survivin的shRNA表达载体。方法合成特异性干扰Survivin的小发卡RNA（shRNA）片段，并与pGenesil2载体连接，构建Survivin干扰载体（pGenesil2SurvivinshRNA）。利用脂质体将其转染Lovo细胞，分为正常细胞对照组和3个shRNA干扰组（pGenesil2Survivin1、2及3），应用荧光显微镜对转染效果进行评价，应用EM培养基，然后用无血清无双抗的DMEM培养基转染。转染6h后换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基，转染

2、后48h盖玻片用荧光显微镜分别观察转染情况。1.4pGenesil2SurvivinshRNA质粒转染人结肠癌Lovo细胞干扰效果的测定实验分为4组，分别为正常细胞对照组、pGenesil2SurvivinshRNA1、2以及3组，每组设4复孔。mol/LPBS缓冲液漂洗3次后加入200μl细胞裂解液混匀、冰浴30min。15000r/min离心10min后，以Loillipore,USA）。以含5％脱脂奶粉的TBS溶液封闭2h，PTTG鼠抗人单克隆一抗和βactin室温孵育2h，相应的二抗室温孵育1.5h，ECL试剂盒显色，拍照。2结果2.1重组载体测序结果pGenesil2

3、Survivin1、2和3的测序结果显示，设计的3对shRNA片段均已成功地连入pGenesil2载体中，即重组载体pGenesil2SurvivinshRNA均构建成功。2.2pGenesil2SurvivinshRNA载体转染Lovo细胞转染效率的测定应用与载体pGenesil2具有基本具有相同序列的pGenesil1载体（pGenesil1中比pGenesil2只多出EGFP蛋白的序列）测定转染效率。转染48h后测定Lovo细胞转染效率结果显示，正常细胞对照组荧光表达百分率约为8%，转染组荧光表达百分率为70%（图1）。即Lovo细胞的转染效率约为62%，已经可以满足实验需要

4、。图1荧光显微镜下观察Lovo细胞转染2.3pGenesilSurvivinshRNA质粒转染Lovo细胞干扰的检测通过Western印迹测定干扰后Lovo细胞中Survivin蛋白表达情况，pGenesilSurvivinshRNA1、2和3转染Lovo细胞中Survivin蛋白表达干扰效率分别为78%、65.2%和69.3%（图2）。图2转染pGenesilSurvivinshRNA质粒后Lovo细胞Survivin表达情况3讨论RNAi介导的特异性同源基因mRNA降解的一种细胞反应过程，是转录后基因沉默(pTGs)的一种形式。RNAi首先由Fier等人于1998年发现并命名〔6〕

5、。目前已发现RNAi具有多方面的显著特点〔7～9〕：①高特异性，siRNA引起同源基因mRNA的降解具有高度的特异性，因为即使一个碱基的改变往往就会大大降低甚至完全丧失siRNA对靶基因的抑制作用；②高效性，RNAi过程一旦被启动，反应信号就可以被一定程度地扩增和放大，最低每个细胞内一份拷贝的siRNA就足以达到基因抑制的效果；③高稳定性，通过采用RNAi对线虫全基因组功能进行分析的结果显示，其中50%～80%的序列选择有效，12.9%～27%的基因抑制产生了明显的异常表型，因此RNAi作用具有很高的成功率和稳定性。④此外，RNAi还具有研究周期短、操作简单等突出优点。由于RNAi所具

6、有的上述重要特点，使得它在发现后迅速地发展并展示了其在生命科学研究中有极其广阔的应用前景。RNAi的主要应用方向包括〔8，10，11〕：①研究基因功能，在后基因组时代规模性的基因功能研究中，通过RNAi特异性抑制基因的表达可获得特定蛋白功能丧失或降低的突变体，从而借以阐明特定基因在生物体中的功能。②疾病基因治疗，由于RNAI可以特异性和高效性地抑制基因的表达，毋庸置疑，它将在遗传病、病毒感染和癌症等人类多种顽固性疾病的基因治疗中发挥重要的作用。③新药物研究和开发，RNAi可用作寻找新的药物靶标的有效工具，可高通量地对发现的药物靶基因做功能分析，还可以帮助了解药物作用的生化模式等等。正是

7、由于RNAi在生命科学研究中所具有的重大意义，因此将RNAi技术应用到结肠癌的基因治疗中，在治疗策略上或进行多基因联合治疗，或传统治疗与基因治疗联合应用，恶性结肠癌的基因治疗有望产生突破性进展。本实验表明所构建的pGenesil2质粒载体可有效沉默Lovo细胞中的Survivin基因表达。数据对比分析可以发现，所合成的3组干扰质粒载体中，SurvivinshRNA1组干扰效率最高，对Lovo细胞中Survivin蛋白的沉默效率可以达到70%以上