survivin特异性shrna表达载体的构建及评价

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1、Survivin特异性shRNA表达载体的构建及评价【摘要】目的构建针对人结肠癌细胞系Lovo的高效率沉默Survivin的shRNA表达载体。方法合成特异性干扰Survivin的小发卡RNA（shRNA）片段，并与pGenesil2载体连接，构建Survivin干扰载体（pGenesil2SurvivinshRNA）。利用脂质体将其转染Lovo细胞，分为正常细胞对照组和3个shRNA干扰组（pGenesil2Survivin1、2及3），应用荧光显微镜对转染效果进行评价，应用Western印迹和免疫细胞化学法分析转染后Lovo中Survivin的蛋白表达水平。结果插

2、入片段测序结果与合成shRNA结果一致；转染效率可达70%左右，转染pGenesil2SurvivinshRNA后，3个干扰组的Lovo细胞中Survivin蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P＜0.01）。结论成功构建了能高效沉默Survivin的RNAi表达载体；且pGenesil2Survivin高效抑制结肠癌Lovo细胞中Survivin基因表达。【关键词】RNA干扰；生存素；结肠癌；shRNA研究显示，Survivin9在人结肠癌组织以及细胞系中存在高表达，并与人结肠癌的形成和演进存在密切关系，其作用机制可能涉及促进结肠癌恶性增殖及抗细胞凋亡等多个方面〔1

3、，2〕。因此，靶向Survivin的研究对明确结肠癌的发病及转移机制以及提高结肠癌的疗效均有重要意义〔3～5〕。故本研究利用pGenesil2真核表达载体构建了含高效的靶向Survivin基因的重组载体pGenesil2SurvivinshRNA，并进一步应用其沉默人结肠癌系Lovo的Survivin基因，为探讨Survivin在结肠癌发生、发展中的作用及应用其进行结肠癌的基因治疗奠定实验室基础。1材料与方法1.1材料感受态细胞DH5α为我室保存。干扰载体pGenesil1和pGenesil2购自晶赛公司（pGenesil1载体为带有荧光蛋白EGFP基因的pGenesi

4、l2序列）。质粒DNA纯化试剂盒及质粒小提试剂盒购自Qiagen公司（荷兰）。所用的酶BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA连接酶、SalⅠ和PstⅠ均购自Takara公司（日本）。1.2SurvivinshRNA表达载体构建及鉴定①由Genbank查到Survivin的cDNA序列，根据Ambion公司在线设计软件，筛选3个长度均为19bp的靶定序列，分别为：模板1、2和3分别为正义5′GGACCACCGCATCTCTACA3′，反义5′TGTAGAGATGCGGTGGTCC3′；正义5′GCATTCGTCCGGTTGCGCT3′，反义5′AGCGCAACCGGACGAAT

5、GC3′；正义5′GGCTGGCTTCATCCACTGC3′；反义5′GCAGTGGATGAAGCCAGCC3′的靶基因序列。设计3对寡核苷酸序列设计引物。②引物结构：在设计的寡核苷酸链中，其两端分别为BamHⅠ和HindⅢ9的酶切位点，能与线性化载体直接相连，中间的9个碱基为形成发卡结构的环区，以上序列由上海生工公司合成。③线性化pGgenesil2质粒：载体pGenesil2经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，1％琼脂糖凝胶回收大片段。④发卡shRNA寡核苷酸链的退火：用50μl退火缓冲液分别溶解上述合成的寡核苷酸片段。各取2μl（即2μl正义链+2μl反义链）+16μl

6、退火缓冲液混匀。94℃水浴退火自然冷却至室温。取1μl退火产物+99μlH2O做100倍稀释。⑤重组载体pGenesil2SurvivinshRNA的构建：T4DNA连接酶连接退火寡核苷酸链与线性化载体pGenesil2，建立10μl连接反应体系：取稀释退火寡核苷酸链1μl，线性化pGenesil2质粒载体1μl，10×连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，H2O6μl，22℃水浴反应过夜。⑥细菌转化与质粒提取：取5μl过夜连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布于含Kana抗性（终浓度为30mg/L）的LB平板上，37℃恒温箱培养过夜。从培养皿上挑取3个单克隆菌落接

7、种于3ml含Kana抗性（终浓度为30mg/L）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250r/min）培养过夜。用小提试剂盒小量提取质粒。⑦重组载体的酶切鉴定：质粒分别用PstⅠ和SalⅠ做酶切鉴定，反应条件为：质粒DNA8μl，10×缓冲液1μl，PstⅠ和SalⅠ酶各1μl；37℃水浴反应3h，1%琼脂糖凝胶电泳；送北京英俊公司测序。1.3pGenesilSurvivinshRNA质粒转染人结肠癌Lovo细胞转染效率的测定将Lovo细胞铺于覆有盖玻片的6孔板内，接种密度约为5×9105个/孔。24h后换液，用脂质体Lipo2