survivin shrna真核表达载体的构建及其生物学作用论文

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1、SurvivinshRNA真核表达载体的构建及其生物学作用论文谢富华，吴小云，王润秀，熊亮，梁念慈【摘要】目的：构建存活素（survivin）基因短发夹RNA(shRNA)的表达质粒，为乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.方法：设计并合成有小发夹结构的8条survivinshRNA对应模板序列，退火并与pShuttle1.0CMV载体重组质粒；将重组质粒转染人乳腺癌细胞MCF7；MTT实验筛选出最有效质粒及其有效浓度，流式细胞术检测细胞周期的变化.freelallinterferencingRNA,siRNA）或短发夹RNA

2、(shRNA)表达载体转入哺乳动物细胞中，同样能产生沉默效应.目前，其载体构建大多是用RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子U6或H1进行表达的［2-3］，但是用RNApolⅡ依赖的巨细胞病毒立即早期启动子同样有效［4］.本实验我们设计针对survivin基因的shRNA表达质粒，将其转染人乳腺癌MCF7细胞，初步探讨其诱导MCF7细胞凋亡情况及对survivin基因表达的影响.1材料和方法1.1材料pShuttle1.0CMV载体（产地ambion公司）；Lipofectamine2000转染试剂盒(invitrogen)；各种限制性

3、内切酶和T4DNA连接酶（大连宝生物公司）；总RNA提取试剂盒(加拿大BioBasic公司)；逆转录聚合酶链反应(RTPCR)试剂盒（美国Qiagen公司）.1.2方法1.2.1shRNA的设计根据survivin基因的序列在线设计3个可干扰序列：①5′GGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAAC3′,②5′ACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAA3′,③5′AATTTGAGGAAACTGCGGAGA3′和一个错义序列5′TATGAGAATGGCAGCGAGATA3′（其碱基组成同序列③，但排列

4、顺序不同），同源分析未见相同序列.1.2.2重组质粒的构建和鉴定shRNA转录模板DNA链的设计：按pShuttle1.0CMV载体要求以反向重复方式设计发夹结构：正义链：5′CTAGT反向序列TCTCTTGAA正向序列C3′，反义链：5′TCGAG正向序列TTCAAGAGA反向序列A3′.重组质粒的构建：模板链合成并退火，将其定向克隆至穿梭载体pShuttle1.0CMV中；转化DH5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选单克隆，分别命名为pShuttlesurvivin(13)和pShuttlecontrol.重组质粒

5、的鉴定：提取质粒分别用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，取初步鉴定的质粒送上海生物工程技术服务有限公司测序.1.2.3细胞培养与转染乳腺癌细胞株MCF7用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液培养于37℃含50mL/LCO2的培养箱中.转染前24h将约1×105个细胞接种至6孔板，转染时细胞融合度达30%～50%.按Lipofectamine2000操作手册进行转染：用质粒pShuttlesurvivin(13)以50nmol/L的浓度分别转染细胞，设立阴性（加pShuttlecontrol）和空白对照组（加Lipofe

6、ctamine2000），每组设3个平行孔，培养24h后行MTT检测，筛选出最有效的shRNA表达质粒，将最有效的质粒分别以5，10，50，100，150nmol/L的终浓度转染MCF7细胞，每组设3个平行孔，设立对照组，培养24h后再次行MTT检测［5］.1.2.4流式细胞术检测接种MCF7细胞于60mm平皿中（2×106/皿）.接种后24h，以最有效质粒的最佳浓度转染细胞，设阴性和空白对照组.转染后48h收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清，PBS清洗1次，离心去PBS，加入预冷的700mL/L的乙醇，4℃固定

7、16h以上.离心去乙醇，PBS清洗1次，加0.5mL50mg/LPI（含100mg/LRNaseA）于避光处染色30min，用CoulterEPTCSXL31240流式细胞仪进行检测.1.2.5Hoechst荧光染色检测凋亡取普通洁净盖玻片于750mL/L乙醇中浸泡24h以上，风干，将盖玻片置于六孔板内，种入MCF7细胞培养过夜.加入含最有效质粒的最佳浓度的培养基，作用24h，设阴性和空白对照组.吸尽培养液，加入0.5mL固定液，4℃固定过夜.去固定液，用PBS洗两遍，每次3min，吸尽液体.加入0.5mLHoechst332

8、58染色液，摇床上染色5min.用PBS洗两遍，每次3min.加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，使细胞接触封片液，荧光显微镜检测.1.2.6RTPCR检测按一步法RTPCR试剂盒说明书提取RNA后行PCR.survivin