真核表达载体的构建及其生物学作用

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1、真核表达载体的构建及其生物学作用ok3allinterferencingRNA,siRNA)或短发夹RNA(shRNA)表达载体转入哺乳动物细胞中,同样能产生沉默效应.目前,其载体构建大多是用RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子U6或H1进行表达的[2-3],但是用RNApolⅡ依赖的巨细胞病毒立即早期启动子同样有效[4].本实验我们设计针对survivin基因的shRNA表达质粒,将其转染人乳腺癌MCF7细胞,初步探讨其诱导MCF7细胞凋亡情况及对survivin基因表达的影响.1材料和方法1.1材料pShuttle1.0CMV载体(产地ambion公司);Lipofectamine200

2、0转染试剂盒(invitrogen);各种限制性内切酶和T4DNA连接酶(大连宝生物公司);总RNA提取试剂盒(加拿大BioBasic公司);逆转录聚合酶链反应(RTPCR)试剂盒(美国Qiagen公司).1.2方法1.2.1shRNA的设计根据survivin基因的序列在线设计3个可干扰序列:①5′GGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAAC3′,②5′ACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAA3′,③5′AATTTGAGGAAACTGCGGAGA3′和一个错义序列5′TATGAGAATGGCAGCGAGATA3′(其碱基组成同序列③,但排列顺序不同)

3、,同源分析未见相同序列.1.2.2重组质粒的构建和鉴定shRNA转录模板DNA链的设计:按pShuttle1.0CMV载体要求以反向重复方式设计发夹结构:正义链:5′CTAGT反向序列TCTCTTGAA正向序列C3′,反义链:5′TCGAG正向序列TTCAAGAGA反向序列A3′.重组质粒的构建:模板链合成并退火,将其定向克隆至穿梭载体pShuttle1.0CMV中;转化DH5α感受态细胞,氨苄青霉素筛选单克隆,分别命名为pShuttlesurvivin(13)和pShuttlecontrol.重组质粒的鉴定:提取质粒分别用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切,取初步鉴定的质粒送上

4、海生物工程技术服务有限公司测序.1.2.3细胞培养与转染乳腺癌细胞株MCF7用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液培养于37℃含50mL/LCO2的培养箱中.转染前24h将约1×105个细胞接种至6孔板,转染时细胞融合度达30%~50%.按Lipofectamine2000操作手册进行转染:用质粒pShuttlesurvivin(13)以50nmol/L的浓度分别转染细胞,设立阴性(加pShuttlecontrol)和空白对照组(加Lipofectamine2000),每组设3个平行孔,培养24h后行MTT检测,筛选出最有效的shRNA表达质粒,将最有效的质粒分别以5

5、,10,50,100,150nmol/L的终浓度转染MCF7细胞,每组设3个平行孔,设立对照组,培养24h后再次行MTT检测[5].1.2.4流式细胞术检测接种MCF7细胞于60mm平皿中(2×106/皿).接种后24h,以最有效质粒的最佳浓度转染细胞,设阴性和空白对照组.转染后48h收集细胞,1000r/min离心5min,弃上清,PBS清洗1次,离心去PBS,加入预冷的700mL/L的乙醇,4℃固定16h以上.离心去乙醇,PBS清洗1次,加0.5mL50mg/LPI(含100mg/LRNaseA)于避光处染色30min,用CoulterEPTCSXL31240流式细胞仪进行检测

6、.1.2.5Hoechst荧光染色检测凋亡取普通洁净盖玻片于750mL/L乙醇中浸泡24h以上,风干,将盖玻片置于六孔板内,种入MCF7细胞培养过夜.加入含最有效质粒的最佳浓度的培养基,作用24h,设阴性和空白对照组.吸尽培养液,加入0.5mL固定液,4℃固定过夜.去固定液,用PBS洗两遍,每次3min,吸尽液体.加入0.5mLHoechst33258染色液,摇床上染色5min.用PBS洗两遍,每次3min.加一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,使细胞接触封片液,荧光显微镜检测.1.2.6RTPCR检测按一步法RTPCR试剂盒说明书提取RNA后行PCR.survi

7、vin基因引物(产物为166bp)P1:5′cagatttgaatcgcgggaccc3′,P2:5′ccaagtctggctcgttctcag3′;GAPDH引物(产物为280bp)P1:5′gtagaggcagggatgatgttc3′,P2:5′gagttagctcactcattaggc3′.反应条件:50℃反转录30min;95℃初始PCR激活反应15min;94℃变性0.5min,55℃退火1min,72℃