shrna表达载体pwh1的构建及用于hif1基因的沉默

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1、shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默作者：吴元明,张晓楠,韩者艺,李春英,陈南春【摘要】　　目的:构建用于RNAi的shRNA（smallhairpinRNA）表达载体及检测其对低氧诱导因子1（HypoxiainducibleFactor1,HIF1）基因的沉默效果。方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFPC1载体片段中,此载体命名为pWH1。以人HIF1cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1。新的载体转染SGC7901细胞,然后用RTPCR和We

2、sternblot检测HIF1基因的表达改变。结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RTPCR和Westernblot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义。【关键词】shRNA表达载体RNA干涉HIF1基因　　[Abstract]AIM:ToconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinRNA（shRNA）andtotestitsefficacyinsile

3、ncingtheHypoxiainducibleFactor1(HIF1)gene.METHODS:TheH1genepromoterwasamplifiedfromthegenomeofthehumanbloodcellsbyPCR.ThenthepromoterwasclonedintothepEGFPC114vectordigestedwiththerestrictionenzyme.TheconstructedvectorwasnamedpWH1.Theprimerwasdesignedtotargetthe

4、humanHIF1cDNAgene.TheannealedprimerfragmentwasclonedintopWH1.ThenewconstructedplasmidwastransfectedintotheSGC7901cellline.ThentheexpressionlevelofHIF1genewasassayedbyRTPCRandWesternblot.RESULTS:ThenewlyconstructedplasmidexpressedshRNAtotargettheHIF1gene.Theresult

5、sofRTPCRandWesternblotshowedtheexpressionofHIF1genewasreduceddramaticalyinmRNAandatproteinlevel.CONCLUSION:ThesuccessfulconstructionofshRNAexpressionvector(pWH1)providesatoolforfurtherresearchintothefunctionofanovelgene.　　[Keywords]shRNA;expressionvector;RNAinter

6、ference;HIF1gene　　RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是将双链RNA（dsRNA）导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉寂（PTGS）的一种。1998年,Fire等[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现,14由正义和反义RNA退火形成的dsRNA引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义RNA强10倍以上。dsRNA引起的基因表达抑制不是正义或反义RNA引起的基因表达抑制在数学上的叠加,这就说明dsRNA触发了细胞内的一些反应机制,从而引起了高

7、效和特异的基因表达抑制效果。当时,他们就把这种现象命名为RNAi。RNAi的应用谱非常广泛,从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫,其次就是果蝇。哺乳动物细胞的RNAi应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。Wianny等[2]将dsRNA用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了RNAi。Sayda等[3]用人工合成的21ntRNA二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了RNAi。Brummelkamp等[4]利用载体表达的shRNA在许多培养的人源,猴源和鼠源的哺乳动物细胞的RNAi实验中取得了成功。　　在真核细胞内,

8、RNA聚合酶III能指导短RNA的表达和RNA聚合酶III结合的启动子有H1,U6等。目前,这两种启动子都被尝试作为表达短RNA的工具。本实验旨在克隆得到的H1启动子的基础上构建一个能稳定表达shRNA的真核载体。然后针对HIF1基因mRNA设计靶标,在培养的SGC7901细胞（胃癌细胞系）内进行RNA