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1、六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响【关键词】六味地黄丸；大鼠；前脂肪细胞；细胞增殖；细胞分化 Abstract：ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofLiuonproliferationofratpreadipocytesethod,theinfluenceofLiuonexpressionofGPDHinedbyenzymetissuechemicalmethod,theeffectonlipidaccumulationinedbyOilRedOstaining.ResultsLiustimu
2、latedratpreadipocyteproliferation,inhibitedGPDHup-regulationduringdifferentiation,inhibitedlipidaccumulationincelldifferentiationulatedratpreadipocyteproliferation,inhibitedratpreadipocytedifferentiation. Keya公司；MTT(批号1313Bl1)购自Amresco公司；标准胎牛血清(批号20050617)购自兰州民海生物工程有限公司；
3、油红0(批号830120)购自北京夏新试剂分装厂。DMSO购自宜兴市化工厂；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。 1.2动物健康EM/低糖培养液5～10mL,塞紧瓶塞,将底面翻转朝上。37℃、5%C02培养1～2h,待粘附牢固后,翻转培养瓶做正常培养,每日观察。原代培养区域单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代,取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验。 2.6油红O染色提取法测定脂肪细胞内脂肪含量 用PBS冲洗2～3次,加入10%的甲醛缓冲液室温下固定1h,去固定液,加入油红O染色,室温下染色2h,去染色剂,以无菌双蒸水冲洗2次,洗去未
4、着色的染料,倒置显微镜下观察,照相。结束后,以异丙醇溶解,490nm酶标仪下测吸光度,以吸光度(A值)表示,画出时间-A值曲线。结果前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7d后迅速增加,11d左右到达高峰,与形态学上的单层汇合后1周左右细胞内出现脂肪颗粒完全吻合。细胞内脂肪含量的增加比GPDH的出现要晚6d左右,说明酶的出现在先,脂肪出现在后。 2.7分组及给药 将第4代的大鼠前脂肪细胞接种到96孔板,贴壁后于96孔培养板每6孔一组,分为4组：10%空白大鼠血清组,六味地黄丸药物血清高、中、低剂量组(浓度分别为10%、5%、2.5%,简
5、称高、中、低剂量组)。上述各组所含血清的终浓度均为10%,血清含量不足者以空白大鼠血清补齐。 2.8六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖的影响 配制大鼠前脂肪细胞增殖培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清,分别与六味地黄丸含药血清共同溶解于培养液中,其终浓度同“2.7”项。取第4代的大鼠前脂肪细胞,以10000个/孔接入96孔培养板中,37℃、5%C02培养12h。分别加入上述配制的各种含药培养液,再培养48h。将浓度为5g/LMTT液与10%空白大鼠血清的DMEM培养液按体积(1∶9)配成MTT培养液。移出培养液,换上MTT培养液培养4h,
6、吸干培养液,每孔加100μLDMSO,混匀后置酶标仪490nm观测吸光度值,观察各浓度含药血清对前脂肪细胞增殖的影响,测定各孔吸光度(A值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。结果见表1。 2.9六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶的影响 配制大鼠前脂肪细胞分化培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清＋胰岛素10μmol/L＋地塞米松1μmol/L.以分化培养液配制不同浓度六味地黄丸含药血清培养液,其终浓度同“2.7”。取第4代的细胞以30000个/孔接种于96孔培养板中,37℃、5%CO2培养5d,分别加入
7、上述配制的各培养液,再培养5d。培养结束后,酶组织化学提取法测定GPDH的活性,紫外分光光度计340nm波长处观测吸光度值。以吸光度(A值)间接表示酶的活性,6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行统计分析。结果见表1。 2.10六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响 培养液的配制同“2.7”项,取第3代的大鼠前脂肪细胞以30000细胞/孔接种入96孔培养板中,于37℃、5%CO2培养10d后,加入“2.7”项配制好的含药培养液,再于同样条件下培养5d。培养结束后,细胞用10%的甲醛固定1h,用油红0工作液(2g/L)染
8、色2h,用双蒸水充分洗净,培养板放入37℃温箱使残余水分蒸发,用异丙醇溶解细胞内油红0,置酶标仪510nm观测吸光度(A值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。结果见表1。表1
