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1、六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响论文.freelonproliferationofratpreadipocytesethod,theinfluenceofLiuonexpressionofGPDHinedbyenzymetissuechemicalmethod,.freelulationinedbyOilRedOstaining.ResultsLiustimulatedratpreadipocyteproliferation,inhibitedGPDHup-regulationduringdifferentiation,in
2、hibitedlipidaccumulationincelldifferentiationulatedratpreadipocyteproliferation,inhibitedratpreadipocytedifferentiation.Keya公司；MTT(批号1313Bl1)购自Amresco公司；标准胎牛血清(批号20050617)购自兰州民海生物工程有限公司；油红0(批号830120)购自北京夏新试剂分装厂。DMSO购自宜兴市化工厂；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。1.2动物健康EM/低糖培养液5～10mL,塞紧瓶塞,将底面
3、翻转朝上。37℃、5%C02培养1～2h,待粘附牢固后,翻转培养瓶做正常培养,每日观察。原代培养区域单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代,取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验。2.4大鼠前脂肪细胞生长曲线按文献3方法测定,从生长曲线可见前脂肪细胞的倍增时间约为60h。2.5酶组织化学提取法测定大鼠前脂肪细胞分化过程中的标志物――甘油磷酸脱氢酶(GPDH)动态变化根据文献4的方法进行测定。结果传代细胞形成单层汇合后,在胰岛素10μmol/L和地塞米松1μmol/L的作用下即开始上升并迅速增加,10d左右到达高峰并维持在高水平。形态上
4、表现为单层汇合1周后,细胞内出现大量脂滴。2.6油红O染色提取法测定脂肪细胞内脂肪含量用PBS冲洗2～3次,加入10%的甲醛缓冲液室温下固定1h,去固定液,加入油红O染色,室温下染色2h,去染色剂,以无菌双蒸水冲洗2次,洗去未着色的染料,倒置显微镜下观察,照相。结束后,以异丙醇溶解,490nm酶标仪下测吸光度,以吸光度(A值)表示,画出时间-A值曲线。结果前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7d后迅速增加,11d左右到达高峰,与形态学上的单层汇合后1周左右细胞内出现脂肪颗粒完全吻合。细胞内脂肪含量的增加比GPDH的出现要晚6d左右,说
5、明酶的出现在先,脂肪出现在后。2.7分组及给药将第4代的大鼠前脂肪细胞接种到96孔板,贴壁后于96孔培养板每6孔一组,分为4组：10%空白大鼠血清组,六味地黄丸药物血清高、中、低剂量组(浓度分别为10%、5%、2.5%,简称高、中、低剂量组)。上述各组所含血清的终浓度均为10%,血清含量不足者以空白大鼠血清补齐。2.8六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖的影响配制大鼠前脂肪细胞增殖培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清,分别与六味地黄丸含药血清共同溶解于培养液中,其终浓度同“2.7”项。取第4代的大鼠前脂肪细胞,以10000个/孔接入96孔培
6、养板中,37℃、5%C02培养12h。分别加入上述配制的各种含药培养液,再培养48h。将浓度为5g/LMTT液与10%空白大鼠血清的DMEM培养液按体积(1∶9)配成MTT培养液。移出培养液,换上MTT培养液培养4h,吸干培养液,每孔加100μLDMSO,混匀后置酶标仪490nm观测吸光度值,观察各浓度含药血清对前脂肪细胞增殖的影响,测定各孔吸光度(A值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。结果见表1。2.9六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶的影响配制大鼠前脂肪细胞分化培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血
7、清＋胰岛素10μmol/L＋地塞米松1μmol/L.以分化培养液配制不同浓度六味地黄丸含药血清培养液,其终浓度同“2.7”。取第4代的细胞以30000个/孔接种于96孔培养板中,37℃、5%CO2培养5d,分别加入上述配制的各培养液,再培养5d。培养结束后,酶组织化学提取法测定GPDH的活性,紫外分光光度计340nm波长处观测吸光度值。以吸光度(A值)间接表示酶的活性,6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行统计分析。结果见表1。2.10六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响培养液的配制同“2.7”项,取第3代的大鼠前脂
8、肪细胞以30000细胞/孔接种入96孔培养板中,于37℃、5%CO2培养10d后,加入“2.7”项配制好的含药培养液,再于同样条件下培养5d。培养结束后,细胞用10%的甲醛固定1h,用油红0工作液(2g/L)染色2h,用
