黄芪多糖对3t3l1前脂肪细胞增殖和分化的影响论文

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1、黄芪多糖对3T3L1前脂肪细胞增殖和分化的影响论文刘毅,王文健,陈伟华,应健【关键词】黄芪多糖;增殖;分化;mRNA;前脂肪细胞近年来许多研究表明，黄芪及其主要成分黄芪多糖（Astragaluspolysaccharides,APS）可以调节糖脂代谢，具有改善胰岛素抵抗的作用，因此广泛运用于2型糖尿病、肥胖和代谢综合征等代谢相关性疾病的防治［1~4］。在以往的实验中，我们发现黄芪多糖可增加脂肪细胞葡萄糖的摄取和利用，促进前脂肪细胞的分化［3］，为了进一步探讨其影响前脂肪细胞增殖和分化的机制，本研究从影响脂肪细胞分化的两个主要基因过氧化物体增殖剂活化受体

2、γ（peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ,PPARγ）和CAAT/增强子结合蛋白α（CAAT/enhancerbindingproteinα,C/EBPα）mRNA与蛋白质水平.freelericanTypeCultureCollection（ATCC）产品；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco'smodifiedeagle'smedium,DMEM）、特级新生小牛血清、胎牛血清，Gibco公司产品；胰蛋白酶、青霉素G钠盐、硫酸链霉素、焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate,DEPC）和溴

3、化乙啶，Amresco公司产品；APS由复旦大学内分泌研究所提供；胰岛素、地塞米松、异丁基3甲基黄嘌呤、二甲氧唑黄｛2,3bis(2methoxy4nitro5sulfophenyl)5［(phenylamino)carbonyl］2Htetrazoliumhydroxide,XTT｝、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）、酶标二抗，Sigma公司产品；罗格列酮（rosiglitazone,ROS），浙江天马医药化工有限公司产品；Trizol试剂，Invitrogen公司产品；硝酸纤维素膜，EM，在37℃

4、、5%CO2的条件下培养，细胞状态良好时接种于培养板，待细胞生长至融合2d后，加含0.5mmol/L异丁基3甲基黄嘌呤、0.25μmol/L地塞米松、10μg/ml胰岛素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养48h，换以含10μg/ml胰岛素的培养液再培养48h，随后以含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养，每隔2d换1次培养液，诱导分化8～12d的3T3L1细胞85%以上呈脂肪细胞表型，可用于实验。1.2.2XTT法检测APS对3T3L1前脂肪细胞增殖的影响将3T3L1前脂肪细胞按照不同的细胞浓度接种于96孔板，通过XTT法测定570nm波

5、长的吸光度值（OD570值），建立“OD570值细胞数目”曲线。然后再按1.5×104/ml3T3L1前脂肪细胞的浓度接种96孔板，每孔100μl培养基，细胞贴壁后分别加不同浓度的APS（0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8g/L）干预培养，通过XTT法分别检测各组的OD570值，通过“OD570值细胞数目”曲线计算出加药24、48和72h时的细胞数目。1.2.33T3L1前脂肪细胞分化的定量检测将3T3L1前脂肪细胞按上述方法诱导分化。设置空白对照组（normalcontrol,.freelol/L，CON组加等体积生理盐水。

6、在加分化液同时加药，药物与培养液同步更换。分化第8天进行油红O染色，拍摄照片。异丙醇处理已染色的细胞，裂解细胞后通过酶标仪对脂滴着色程度进行比色，570nm波长检测OD值，定量分析细胞的分化程度。1.2.4APS对脂肪细胞PPARγ和C/EBPαmRNA表达的影响在12孔培养板中，前脂肪细胞的分化培养和药物干预分组同前，在分化第8天时弃培养上清，收集细胞备用，实时聚合酶链式反应检测PPARγ和C/EBPαmRNA的表达。参照TrizolReagent试剂盒抽提取各组细胞总RNA，取1μlRNA样本加99μl超纯水，在紫外分光光度计上比色进行RNA定量，用

7、A260和A280的比值确定RNA的纯度，所有RNA样品A260/A280在1.7～1.9之间。PPARγ上游引物5’GACCACTCGCATTCCTTT3’，下游引物5’CCACAGACTCGGCACTCA3’，PCR产物266bp；C/EBPα上游引物5'GGAAAGAAACGACTGGGAGC3'，下游引物5'CGACTAGACGCTATTGTGATT3’，PCR产物214bp；GAPDH上游引物5’AAGGTCGGAGTCAACGGATT3’，下游引物5’CTGGAAGATGGTGATGGGATT3’，PCR产物222b

8、p。以上引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。RNA的反转录：以AMV第一链