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时间:2018-05-04
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1、西安市麻疹野病毒核蛋白基因序列分析作者:司源,李平,侯铁军,孙亚辉,关蓉晖,姬亦昕,王枫【关键词】麻疹【Abstract】AIM:TostudythegenotypeandcharacteristicsofmeaslesvirusfoundinXiancity.METHODS:Measlesvirusesthepharynxseaslespatientsergence.ThetotalRNAthemeaslesvirusbythephenolchloroformextractionmethod.Thenp
2、lifiedthe450bpnucleotidesegmentofcarboxylterminalregionofnucleoprotEingenebyRTPCR,determinedthesequenceoftheamplifiedsegments,analyzedandparedthesequenceeaslesvirus13samplesofpharynxseaslesvirus.CONCLUSION:H1genotyperemainspredominantstrainofmeaslesvirusc
3、irculatinginXiancity,easlesviruscirculatinginChina.【Keyeaslesvirus;nucleoproteingene;sequencinganalysis;RTPCR【摘要】目的:研究西安市流行麻疹病毒的基因型别及特征.方法:采集3d内出疹麻疹患者咽拭子标本分离病毒,提取病毒RNA,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增病毒的核蛋白N基因碳末端的450bp的核苷酸片段,对扩增产物进行序列测定和比较分析.结果:采集咽拭子标本13份,分离出麻疹病毒8株,分离率
4、62%;8株麻疹病毒均为H1基因型.结论:H1基因型麻疹病毒是西安市麻疹病毒的优势流行株,与全国麻疹病毒流行株无明显差异.【关键词】麻疹病毒;核蛋白基因;序列分析;RTPCR0引言麻疹病毒只有一个血清型,但近年来国内外通过对麻疹病毒的基因分析,已发现有8个基因组(A~H),共20个基因型在人类中流行或曾经流行.在麻疹病毒的结构基因中,核蛋白(N)基因和血凝素(H)基因是变异最大的基因,而N基因碳末端450个核苷酸为该基因最大变异区.世界卫生组织(EM培养液中,-20℃冻存.1.2方法1.2.1病毒分离标本
5、接种在EtsteinBarr(EB)病毒转化的狨猴淋巴母细胞(B95a)上,吸附1h后弃上清,换含20mL/L小牛血清RPMI1640培养液8mL,培养14d,每天观察细胞液pH值和细胞病变(CPE),必要时换液或盲传1代,当CPE≥75%时收冻.用兔抗麻疹免疫血清对分离株作中和鉴定.1.2.2RNA提取和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)用酚氯仿抽提法提取病毒悬液中的RNA[1-3].参照H1基因型和Edmonston株的序列设计引物,上游引物为601(序列为5′GCATATTTTAGATTAGG3′),
6、下游引物为631(序列为5′GGCGGCCTTTTGCACCTAGT3′).601和631引物分别位于N基因起始编码1079~1096和1576~1595处.用于扩增N基因碳末端的516个核苷酸(bp)片段.在逆转录酶的作用下,用下游引物631于PCR仪上42℃45min,95℃5min,合成cDNA.用601,631引物和PCR试剂盒进行PCR扩增,首先高温启动95℃1min,然后进行30个循环的扩增:95℃45s,50℃45s,72℃1min;最后72℃延伸10min.每次实验设去离子水为阴性对照,扩
7、增后的产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,用QIAquickPCRpurificationkit试剂盒纯化扩增产物.1.2.3序列测定使用601引物和BigDyeTMTerminatorV3.0CycleSequencingReadyReactionKit试剂盒进行标记反应,标记反应如下:90℃10s,50℃5s,70℃4min,共25个循环,最后70℃10min延伸.标记后的产物在CENTRISEPCOLUMNS试剂盒再一次纯化,去除多余非特异性荧光.纯化后的产物在ABI377测序仪上,经50g/L聚丙
8、烯酰胺、8.3mol/L尿素凝胶电泳,自动完成序列测定和校对分析[4-6].1.2.4序列分析调出GeneBank里的20个基因型代表株,用BioEdit软件对这些参考株和我们分离的8个毒株N基因的450bp序列进行变异对比分析和基因亲缘性分析,做基因亲缘性关系树.2结果2.1麻疹病毒分离和鉴定13份标本中有8份标本在B95a细胞上出现细胞融合病变.经中和试验鉴定,全部为麻疹病毒.麻疹病毒分离率为62%.野毒株标准命名见表1.
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