猪瘟病毒2.1基因亚型野毒株的体外细胞传代适应与全基因组序列分析

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分类号：S852.65单位代码：10193密级：公开学号：2012658硕士学学位位论文猪瘟病毒2.1基因亚型野毒株的体外细胞传代适应与全基因组序列分析Invitroisolationandcelladaptationofwildtypeclassicswinefevervirussub‐subgenotype2.1anditsfullgenomicsequence作者姓名：谢晓明学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物病毒学指导教师：王全凯所在学院：动物科学技术学院二〇一五年五月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 吉林农业大学硕士学位论文摘要摘要猪瘟（Classicalswinefever,CSF）是由猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）引起的一种严重危害全球养猪业的烈性传染病。CSF在全球范围内流行，给全世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。CSFV只有一种血清型，根据病毒基因组5’NTR、E2和NS5B等基因区段的核苷酸序列的差异可将CSFV分为3个基因型，其可进一步分为11个基因亚型（1.1~1.4；2.1~2.3；3.1~3.4）。涂长春等于上世纪九十年代对全国30个省市CSFV临床样品进行病原生态学和分子流行病学调查，研究发现在我国流行的CSFV主要是2.1、2.2、2.3和1.1亚型，而2.1亚型和2.2亚型作为优势毒株在我国的流行范围更广，呈全国性分布。由于2.1基因亚型存在较大的遗传多样性，进而又将其分为2.1a、2.1b、2.1c和2.1d基因亚亚型。陈宁等人对2004至2007年采集自我国华南地区的35份CSFV阳性样品调查时发现，其中34份样品为2.1b亚亚型，只有1份采集于2004年的阳性样品为2.2亚型。这说明2.1亚型是华南地区的主要流行毒株。2009年在我国陕西省首次分离获得了一株2.1a亚亚型毒株SXCDK，蒋大良等报道在湖南和广东等地区流行CSFV2.1c亚亚型的毒株。目前，由于CSF流行在有些国家和地区得到有效控制，有些国家已宣布彻底消灭了CSF，这也使得一些当年的流行毒株成为历史，比如曾在欧洲流行的基因1.1亚型和曾在亚洲流行的3.3和3.4亚型，近年来已鲜有报道。然而，基因2型悄然成为在世界各地广泛流行的优势毒株。20世纪90年代欧洲许多国家曾暴发2.1亚型毒株引起的CSF疫情，而近年来的报道则以2.2亚型和2.3亚型居多。在我国，2.1型毒株也是主要流行毒株。本实验利用RT-PCR从三个广东某猪场的疑似CSF病例中检测出CSFV，并对扩增的E2全长基因进行了序列测定和系统进化分析。结果表明，引发这3起猪瘟疫情的毒株分别属于CSFV2.1b基因亚亚型，命名为GD176；CSFV2.1c基因亚亚型，命名为GD53；CSFV2.1d基因亚亚型，命名为GD19。为了进一步了解该些毒株的复制特点，实验利用PK-15细胞对三株流行毒株进行了体外细胞适应性传代，并对获得的细胞适应毒F46进行了全基因组测序。结果表明三株流行毒株通过在PK-15上不断传代，最终获得了高滴度的适应毒株，GD176的2.68.17滴度从第6代的10TCID50/mL提高至第46代的10TCID50/mL，GD53的滴3.398.53度从第6代的10TCID50/mL提高至第46代的10TCID50/mL，GD19的滴度I 吉林农业大学硕士学位论文摘要2.547.88从第6代的10TCID50/mL提高至第46代的10TCID50/mL。病毒生长动力学结果显示三株流行毒株在感染后72h病毒滴度达到最高值。为了进一步分析三株流行毒株在细胞传代适应过程中的稳定性，实验对不同代次细胞毒的E2全长基因进行了扩增和序列测定，结果发现三株流行毒株的F0与F6、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40和F46的E2基因序列完全一致，这表明囊膜蛋白E2在病毒适应PK-15细胞过程中非常稳定。通过比对三株流行毒株和其他2.1亚型毒株各蛋白的氨基酸序列发现，不同毒株之间同源性最小的病毒蛋白是NS5A，低于病毒囊膜糖蛋白E2。本实验获得了高度适应PK-15细胞的CSFV2.1亚型毒株细胞毒，为以后进行病毒毒力评价、复制和致病特性研究奠定了重要基础。关键词：猪瘟病毒；2.1亚型；细胞适应性传代；全基因组II 吉林农业大学硕士学位论文摘要AbstractClassicalswinefevervirus(CSFV)isthecausativeagentofhighlycontagiousswinediseaseCSFoccurredinmanycountriesovertheworldincludingChina.Genetictypingbasedonthe5’NTR(150nucleotides),E2(190ntand1119nt)andNS5B(409nt)classifiedCSFVisolatesinto3genotypes,whichwerefurtherdividedinto11sub-genotypes(1.1-1.4;2.1-2.3;3.1-3.4).Tuetal.indicatedthatCSFVisolatescollectedfromChinabetween1980sand1990sweredividedintosub-genotypes2.1,2.2,2.3and1.1andthefirsttwogroupsweredominantforCSFoutbreaksatthatperiod.Sincethegeneticdiversitypresentwithinthesub-genotype2.1isolates,itwasfurthersegregatedinto2.1aand2.1b.Chenetal.reportedthat34outof35CSFVisolatescollectedfromsoutheasternChinain2004-2007weregroupedintosub-genotype2.1bandonlyoneisolatecollectedin2004belongstosub-genotype2.2,indicatingthedominantroleof2.1isolatesinCSFoutbreaksinthisepidemicarea.In2009,thefirstandunique2.1aisolateSXCDKwascollectedfromShanxiprovinceinnortheasternChina.Morerecently,2.1cand2.1disolatescollectedfromHunanandGuangdongprovincesin2011werereportedtobetheagentofmanyCSFcases.Fornow,differentstrategiesfordiseasecontrolincludingeradicationandvaccinationwerecarriedoutandlargescaleofCSFoutbreakswasnotoccurred.Inthiscase,manysub-genotypeCSFVisolatesbecamehistory,suchasgenotype1isolatesinEuropeandgenotype3isolatesinAsia.Atthesametime,theswitchofviruspopulationsfromgenotype1orgenotype3togenotype2wasoccurred.InEurope,sub-genotype2.1hascausedtheepidemicofoutbreaksofmanycountriesin1990sandwildboarisolatesofsub-genotype2.2and2.3arecurrentlydominant.InAsia,sub-genotype2.1isolatesbecamedominantinChinaandKorea.RecentlythreeCSF-suspectedclinicalsamplesfromGuangdongprovincewascollectedanddetectedasCSFVpositivebyRT-PCR.Phylogeneticanalysisbasedonthenucleotidesequenceoffull-lengthE2geneshowedthatthe3ofCSFVisolateGD176,GD53andGD19belongstosub-subgenotype2.1b,2.1cand2.1dofCSFV.Tofurtherunderstandthereplicationcharacteristicsofthesesub-subgenotype2.1isolate,GD176,GD53andGD19wasisolatedandadaptedinPK-15cells,whole-genomesequenceofGD176,GD53andGD19cell-adaptedviruswasIII 吉林农业大学硕士学位论文摘要amplifiedandsequenced.AdaptationofGD176inPK-15cellsstartedatF6with2.618.0610TCID50/mLandhasbeenincreasedto10TCID50/mlatF46,Adaptationof2.61GD176inPK-15cellsstartedatF6with10TCID50/mLandhasbeenincreasedto8.062.6110TCID50/mlatF46,AdaptationofGD176inPK-15cellsstartedatF6with108.06TCID50/mLandhasbeenincreasedto10TCID50/mlatF46.GrowthdynamicsofGD176-F46,GD53-F46andGD19-F46withaMOIat0.1indicatedthatthepeaktiterreachedat72hpostinfection(p.i.).TofurtherdefinethestabilityofGD176,GD53andGD19duringcellularadaptation,full-lengthE2genesofdifferentcell-adaptedvirusesofGD176,GD53andGD19weresequenced.Asaresult,E2geneofF0wasfoundtobeidenticalwiththatofF6,F10,F15,F20,F25,F30,F35,F40andF46,indicatingthegeneticstabilityofE2geneduringinvitroadaptationofGD176,GD53andGD19inPK-15cells.Inaddition,comparisonofindividualviralproteinshowedthatthemostvariableproteinbetweenGD176,GD53andGD19andother2.1sub-subgenotypeisolatesisNS5AratherthanviralenvelopeproteinE2.Overall,highlycell-adaptedCSFVsub-subgenotype2.1bstrainGD176,CSFVsub-subgenotype2.1cstrainGD53,CSFVsub-subgenotype2.1dstrainGD19wasobtainedinthisstudyanditwillbeusefulforfuturestudyonviralvirulence,replicationandpathogenesis.Keywords:CSFV;sub-subgenotype2.1;cellularadaptation;genomeIV 缩略词语表（ABBREVIATION）CSFClassicalSwineFever猪瘟CSFVClassicalSwineFeverVirus猪瘟病毒OIEOfficeinternationaldesEpizooties世界动物卫生组织NTRNontranslstedRegion非编码区IFAIndirectFluoresecentAssay免疫荧光鉴定IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GORFOpenReadingFrame开放阅读框μLmicroliter微升minminute分钟hhour时RTReversetranscription反转录PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应VI 吉林农业大学硕士学位论文目录目录摘要............................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III前言...........................................................................................................................................9第一篇文献综述.....................................................................................................................101.1猪瘟概述......................................................................................................................101.2猪瘟病毒的结构和功能..............................................................................................151.3CSFV的分型..................................................................................................................201.4猪瘟的检测与诊断.......................................................................................................21第二篇研究内容.....................................................................................................................23第一章疑似CSF样本检测.....................................................................................................231.1材料..............................................................................................................................231.2方法..............................................................................................................................251.3.结果...............................................................................................................................281.4讨论..............................................................................................................................301.5小结..............................................................................................................................30第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代................................................................322.1材料..............................................................................................................................322.2方法..............................................................................................................................342.3结果..............................................................................................................................362.4讨论..............................................................................................................................432.5小结..............................................................................................................................44第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析.........................................................453.1材料..............................................................................................................................453.2方法..............................................................................................................................463.3结果..............................................................................................................................473.4讨论..............................................................................................................................50结论.........................................................................................................................................60参考文献.................................................................................................................................61VII 吉林农业大学硕士学位论文目录附1：......................................................................................................................................59附2：......................................................................................................................................82附3：......................................................................................................................................63附4：......................................................................................................................................77附5：......................................................................................................................................82附6：......................................................................................................................................87作者简介：.............................................................................................................................81致谢.........................................................................................................................................93VIII 前言猪瘟（Classicalswinefever,CSF）又称欧洲猪热病（Europeanswinefever）或者猪霍乱（Hogcholera），是由猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus,CSFV）引起各年龄段家猪与野猪均可发病的一种烈性接触性病毒传染病，如若爆发将对[1]养猪业造成严重经济损失，并对国内和国际间猪产品贸易造成严重危害。CSF常会引起全身性的出血损伤，根据CSFV的毒力、病毒载量以及宿主自身免疫条件的不同，根据其临床表现可将CSF分为急性、亚急性、慢性和迟发型。其中急性CSF感染最为严重，致死率高，多见于仔猪，主要症状为结膜炎、发热、食欲不振、便秘、典型神经症状兴奋或抽搐、皮肤和其他器官出血等。继发性感[2][3][4][5]染常会造成肠和呼吸系统损伤。迟发型CSF即先天通过患病母猪感染CSFV，感染后的仔猪不产生特异性抗体但却终生带毒，是天然感染源。世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties，OIE）将CSF纳入必须申报的A[6]类16种法定传染病之一的动物传染病目录，我国也将其列为Ⅰ类传染病。9 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测第一篇文献综述1.1猪瘟概述[7]猪瘟最早发生于十九世纪三十年代的美国俄亥俄洲州，直到1903年美国[8]学者多赛特和德希尼兹证实这是由一种滤过性病毒引起的。目前CSF广在欧洲、亚洲、中南美洲的大部分养猪国家都有流行。澳大利亚、爱尔兰、加拿大、新西[9]兰和美国等在强制免疫和实施屠杀病猪后都曾宣布消灭了猪瘟。但近年来，CSF依然存在于拉丁美洲，亚洲、非洲等地，一些宣布已消灭猪瘟的国家如德国、荷兰、比利时等又见猪瘟的报道，如图1-1~1-11所示（OIE，2015，http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseasecontrol/measures），前苏联和东亚地区CSF然让频繁爆发，澳大利亚、北美洲以及一些北欧国家CSF已得到很好地控制。我国自1954年兔化弱毒疫苗HCLV的问世以来，CSF大规模爆发流行受到有效地控制。但近50年来，CSF在我国大部分地区仍有流行，其流行特点由大规模爆发转成发病年龄小，临床表现温和，母婴垂直传播、持续性感染、混合感染以及免疫抑制更为严重等特点。通常CSFV经口鼻传播，然后病毒会首[10]先聚集在扁桃体上皮细胞，并在此处繁殖。然后被转送至淋巴和循环系统继[11][12]而引发白细胞减少、免疫力下降、全身性的血栓等继而不同的发病症状。图1.12010年1月-6月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.1CSFdistributionmapsbyJan-Jun201010 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测图1.22011年1月-6月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.2CSFdistributionmapsbyJan-Jun2011图1.32011年7月-12月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.3CSFdistributionmapsbyJul-Dec201111 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测图1.42012年1月-6月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.4CSFdistributionmapsbyJan-Jun2012图1.52012年7月-12月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.5CSFdistributionmapsbyJul-Dec201212 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测图1.62013年1月-6月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.6CSFdistributionmapsbyJan-Jun2013图1.72013年7月-12月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.7CSFdistributionmapsbyJul-Dec201313 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测图1.82013年1月-6月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.8CSFdistributionmapsbyJan-Jun2013图1.92013年7月-12月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.9CSFdistributionmapsbyJul-Dec201314 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测图1.102014年1月-6月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.10CSFdistributionmapsbyJan-Jun2014图1.112014年7月-12月世界猪瘟病毒疫情分布图Fig1.11CSFdistributionmapsbyJul-Dec20141.2猪瘟病毒的结构和功能CSFV属于黄病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒属（Pestivirus），与其同属的有牛病毒性腹泻病毒1型（Bovineviraldiarrheavirus-1,BVDV-1）、牛病毒性腹泻病毒2型（Bovineviraldiarrheavirus-2,BVDV-2）和羊边界病毒（Borderdisease[13]virus,BDV）。CSFV是单股正链RNA病毒，沉降系数为40-50S，分子量为8[14][15]4x10u，大小约12.3kb，两侧是5’非编码区或非翻译区(5’-noneodingregion[16]或5’-untrnaslatedregion,5’-NTR)和3’非编码区(3’-untrnaslatedregion,3’-NTR)。中间含有一个大的开放阅读框，其编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋15 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测白。在宿主蛋白水解酶或病毒自身的蛋白水解酶的作用下，多聚蛋白被裂解产生pro12种病毒蛋白（图2），其中8种为非结构蛋白（N,P7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,rns[17]NS5A和NS5B），4种为结构蛋白（Core,E,E1和E2）。图2猪瘟病毒石门株基因组结构及编码蛋白Fig.2GenomestructureandencodedproteinofclassicalswinefevervirusShimenstrain[18]Meyers等人于1987年首次对CSFV强毒株Alfort/T株全基因组序列完成了序列测定，测序结果显示Alfort/T株全基因组长12284bp，5’-UTR363bp，3’-UTR224bp中间有一个大的开放阅读框（Openreadingform,ORF），这个大的开放阅读框可编码由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。[19]Moormann等人于1990年完成了Berscia株全基因组序列的测定，并确定了囊膜蛋白E2的位置。Brescia株全长约12283bp，并对ORF的氨基酸序列的潜在糖基化位点、cys残基和碱性氨基酸的分布和数目、等结构蛋白相关的特征和参数等进行了推测与分析，他认为CSFV结构蛋白的编码区位于基因组的5’端，[20]Stark等的研究也证实了这一点，并进一步测定了CSFV糖蛋白的顺序（gp44/gp48-gp33-gp55）。[21]Moormann等于1996年完成了我国CSFV兔化弱毒株HCLV的全基因组序列测定，测序结果表明HCLV株全基因组序列全长12311bp，3’-UTR243bp，5’-UTR373bp。在3’-UTR中有一个13bp的插入片段UUUUCUUUUUUUU。3’-UTR与5’-UTR在瘟病毒中高度保守，HCLV株中3’-UTR13bp片段的插入可能跟HCLV株的致弱有关。[22]WongML等于2001年完成了LPC株的全基因组序列测定，测序结果表16 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测明LPC株全基因组序列全长12344bp，3’-UTR278bp，5’UTR373bp，中间一个大的开放阅读框编码一个有3897个氨基酸组成的多聚蛋白。系统进化分析结果表明LPC株与HCLV株、Brescia株、Alfort株亲缘关系较近。另外分析还发现LPC株和HCLV株位于3’-UTR有一个13bp的富T序列插入，LPC在这个插入序列之后还有一个28bp的poly-T的特殊的插入序列。我国的CSFV分子生物学研究开展的较晚，但是随着近年来生命科学研究在[23]我国突飞猛进的进展在CSFV分子生物学领域已取得较大进展。王家富等于[24]1998年完成了HCLV株和石门株的全基因组序列测定。黄茜华等于1999年构建了石门株全长基因组cDNA文库。1.2.1CSFV核衣壳蛋白C[24]C蛋白是由86个氨基酸残基构成的约14.3kd的核衣壳蛋白，位于整个多聚[25]169[26][27]蛋白的N端的Npro和Erns之间，另外C蛋白上的S是Npro的作用位点，268[24][27]A是信号肽酶作用位点。C蛋白的基本功能是包裹CSFV基因组RNA以[28]保护病毒基因组，起到封闭屏障的作用，C蛋白上面的一些抗原表位对T淋巴细胞和B淋巴细胞接到的免疫应答有重要关系，是宿主细胞介导反应的相关[29][30][31]靶蛋白。同时，C蛋白还在病毒的翻译和病毒粒子成熟过程中起着重要[36]用。在丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV）中已经证明C蛋白是一种非常稳定的RNA伴侣，在体外能够修改HCV的基因组RNA结构，为了探索在黄病[37]毒科其他成员中是否也存在这种情况，Roland等人从西尼罗河病毒（WestNileVirus,WNV）、乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）和牛病毒性腹泻病毒（BovineViralDiarrheaVirus，BVDV）中观察C蛋白和分子伴侣的活动，结果发现RNA伴侣在黄病毒科其他成员的C蛋白上是非常保守的，C蛋白可能在核衣壳形成和病毒复制期间使病毒RNA发生重排。rns1.2.2囊膜糖蛋白Erns也称作E0，由于囊膜糖蛋白E（EnvelopeproteinRNasesecreted）具有Rnaserns[38]活性，因此称为E，是CSFV表面蛋白目前已知的唯一具有Rnase酶活性的结构蛋白，可能在CSFV粒子的复制过程起着重要作用。病毒粒子中的成熟Erns[以二硫键（S-S键）相连成同源二聚体的形式存在，分子量约100kDa，而单体39][40]是由227个氨基酸残基构成的，分子量大小约44-48kDa，S-S键是维持蛋白质天然结构最理想的结构元件，S-S键主要是链接两个Cys之间的元件，在[41]Erns单体上存在9个Cys。而以二聚体形式存在的Erns存在4个分子内S-S38821101551141386869键（C与C、C与C、C与C、C与C）以及1个分子间S-S键17 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测171171[40]（二聚体形式上的L与单体形式上的C）。Erns的N端糖基化水平很高，[41]有7个假定的糖基化位点，其中5个已经蛋白质电泳得到证实。而C端具有介导全囊膜糖蛋白Erns易位的功能。Erns还具有免疫抑制和神经毒害作用，通[42][43][44]过够抑制内皮细胞蛋白与淋巴细胞的合成体现细胞毒性。Erns诱导的中[45][46]和抗体就能够抵抗CSFV的毒性，因此Erns也是预防CSFV的重要靶蛋白[47][48]。1.2.3糖蛋白E1糖蛋白E1是CSFV三个囊膜蛋白中最小的一个，是一个由195个氨基酸构[54]成的分子量大小约33kDa的蛋白。E1包含位于N端的胞外功能区和位于C端[42]的疏水区将病毒锚定于细胞膜上，属于I型跨膜蛋白。Risatti等研究发现在C末端插入一个19个氨基酸残基的特殊序列会使强毒株Brescia株毒力致弱，这说[55]明E1的C端与CSFV毒力密切相关。E1作为糖蛋白自认同病毒与宿主细胞的识别、吸附等密不可分。研究表明，对E1后期的糖基化修饰对CSFV毒力的[56][57][58][59]影响很大。由此可见糖蛋白E1的主要参与病毒和宿主的识别、吸附、病毒毒力的强弱、病毒的复制以及后期装配。1.2.4糖蛋白E2糖蛋白E2与E1和Erns共同组成了CSFV的囊膜蛋白，E2是一个由396个[60]氨基酸构成的分子量大小约51-58kDa的糖蛋白。在病毒感染宿主细胞时作为[61][62]中和抗体来诱导机体产生免疫反应。在CSFV囊膜的生成或者感染宿主细胞过程中，E2通常通过Cys之间的S-S键与自身形成同源二聚体或者与E1形成[63][64]异源二聚体而发挥作用，而S-S键也是维持E2主要空间结构的重要元件。E2有15个高度保守的Cys残基，有6个位于N端，其余9个位于C端（4aa、48aa、103aa、129aa、139aa、167aa、180aa、188aa、204aa、207aa、225aa、241aa、[65]256aa、277aa、294aa）。E2同E1一样，也属于I型跨膜蛋白，包含位于N端的胞外功能区和位于C端的疏水区将病毒锚定于细胞膜上。E2是病毒的复制、识别宿主细胞与受体结合、介导病毒入侵宿主细胞有重要作用的囊膜蛋白，能够诱导宿主产生CSFV中和抗体。由于不同亚型间E2的核苷酸差异较大，因此也常用来做CSFV进化和分型的依据。E2是CSFV最主要的抗原性蛋白，E2上的B细胞表位可诱导机体产生保护性免疫。深入研究E2的抗原结构对预防和消灭CSFV至关重要。在E2的N端胞外功能区有A、B、C、D4个抗原结构域，A区又可以分为A1、A2和A3三[66][67]个亚区。其中A1、B和C区是中和抗原区，A1、A2和B区是保守区，A3、[68][69][70]C和D区是非保守区（见图3）。4个抗原结构域组成了B/C和A/D两693737个相对独立的抗原区。B/C区是通过L和L形成的S-S键相连接，A/D区是18 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测792856818828[71][72]通过L和L以及L和L形成的2个S-S键相连。图3E2蛋白A、B、C、D抗原区的模式图Fig.3AntigenregionA,B,C,DpatterndiagramofE2protein图4E2蛋白A、B、C、D四大抗原的空间结构模拟图Fig.4A,B,C,DantigensspatialstructuresimulationofE21.2.5CSFV的非结构蛋白除了5个结构蛋白外，CSFV还编码7个非结构蛋白：p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B，这些非结构蛋白在CSFV的复制、组装等方面也起着至关重要的作用。Npro是CSFV一种重要的功能性蛋白，但并不是病毒复制所必需的蛋白。[73]Npro是一种自身蛋白裂解酶，其末端氨基酸编码序列参与病毒蛋白转录的启动Npro抑制宿主产生IFN-α/β，降解IRF-3（干扰素因子，IRF-3能诱导干扰素产生）。将CSFVNpro整个基因敲除后毒力减弱。用鼠Ubi替换Npro后，病毒的生长特19 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测性并不改变，说明其为复制非必须蛋白。CSFVP7位于结构蛋白E2和非结构蛋白NS2之间，是一个由67-70个氨基酸组成的分子量约约7kDa的双刺跨膜蛋白，存在于所有瘟病毒属的病毒中，结构非常稳定，推测可能发挥着同样作用。人们长期以来忽视了对其的研究。可能与病毒出芽相关，感染细胞中E2-P7断裂不完全，以E2-P7和E2两种形式存在，[74]但病毒粒子中仅有E2蛋白。Gladue等发现P7蛋白在CSFV复制过程中发挥重要作用，将P7基因不同氨基酸位点进行定点突变可使病毒毒力减弱。这表明P7蛋白在病毒增殖复制过程中具有重要的作用，可能与病毒蛋白转运、病毒粒子组装、释放密切关系。在病毒蛋白翻译过程中NS2和NS3会形成二聚体，最为保守，其中NS2为[75]一种自身裂解酶，裂解NS2-NS3二聚体后可产生具有生物学活性的NS3蛋白。NS2虽是复制非必须蛋白，但是缺失NS2后可引起细胞产生病变。NS3蛋白是一种多功能酶，具有丝氨酸蛋白酶、核苷酸磷酸酶和RNA解旋酶活性，对病毒[76][77][78][79]复制、蛋白成熟和病毒组装发挥关键作用。NS3可通过其蛋白酶结构[80]域与NS5B结合，从而增强NS5BRNA依赖性RNA复制酶活性。目前关于CSFVNS4A和NS4B蛋白功能方面研究的相关报道较少，有研究表明NS4A与NS2-NS3功能的发挥相关，NS4A与NS2-NS3的协同作用有利于[81感染性病毒粒子的形成。同时NS4A协助NS3完成NS4B/NS5A/NS5B之间的切割加工。NS4B可与NS5A及NS5B形成RNA复制复合体。NS4B具有核苷三磷酸酶（NTPase）功能，将该酶的活性位点进行基因突变可使病毒复制能力明[82]显致弱甚至丧失复制能力，证明NS4BNTPase活性与病毒增殖密切相关目前针对CSFVNS5A蛋白的相关研究甚少。Sheng等分别将CSFV石门株基因序列中编码NS3、NS5A和NS5B区域核苷酸进行点突变，转染PK-15细胞后发现，NS3和NS5B区域突变后便不能复制出子代病毒，而NS5A的突变并不[83]影响病毒复制，说明NS5A蛋白并不直接参与CSFV的复制。在CSFV复制过程中，NS5A通过调节NS5B与RNA3`端非翻译区结合机制来影响病毒RNA[84][85]复制。NS5A能与CSFVIRES位点结合，并能抑制IRES介导的蛋白翻译[86]水平，表明NS5A在病毒复制与蛋白质翻译之间调控方面发挥重要作用。NS5B为RNA依赖性聚合酶，可能参与病毒基因组RNA的合成。在细胞质中NS5B参与病毒基因组RNA合成互补的负链RNA，以负链RNA为模板合成大量病毒基因组RNA。1.3CSFV的分型CSFV只有一种血清型，但是根据病毒基因组5’NTR、E2和NS5B等基因区段的核苷酸序列的差异性可将CSFV划分为3个基因型，其可进一步分为1120 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测[87][88][89][90]个基因亚型（1.1~1.4；2.1~2.3；3.1~3.4）。涂长春等于上世纪九十年代对全国30个省市CSFV临床样品进行病原生态学和分子流行病学调查，研究发现在我国流行的CSFV主要是2.1、2.2、2.3和1.1亚型，而2.1亚型和2.2亚型作为优势毒株在我国的流行范围更广，呈全国性分布。由于2.1基因亚型存在[91][92]较大的遗传多样性，进而又将其分为2.1a和2.1b基因亚亚型。陈宁等人对2004至2007年采集自我国华南地区的35份CSFV阳性样品调查时发现，其中34份样品为2.1b亚亚型，只有1份采集于2004年的阳性样品为2.2亚型。这说明2.1亚型是华南地区的主要流行毒株，且2.1b亚亚型毒株占据优势地位。2009[94][95]年在我国陕西省首次分离获得了一株2.1a亚亚型毒株SXCDK，蒋大良等报道在湖南和广东等地区流行CSFV2.1c亚亚型的毒株。1.4猪瘟的检测与诊断1.4.1CSFV的临床诊断CSF是由CSFV引起的一种烈性、高热、致死性传染病，一旦爆发会对养猪业造成巨大损失。虽然大部分猪场均按照我国CSFV免疫制度进行免疫，但CSF[3]疫情还是时有报发，屡禁不止。显然是有些CSFV疫苗保护效率还不够，不能保护全部的免疫动物，而一些未进行CSFV免疫的小型、个体养殖户成了天然的CSFV疫源地。所以，严格的免疫制度以及接种后的免疫防备、根据临床症状进行准确的诊断尤为重要，因此，猪场应该按时对CSF进行临床检疫，快速、准确的诊断，及时淘汰病猪能够防止猪瘟大规模爆发，保护养猪业。猪瘟的临床症状主要是体温突增至41℃-42℃，持续高烧不退；食欲不振，主要特点是患病猪将嘴巴放到食槽上扫过又回到休息处；精神不振，侧卧嗜睡，后肢有力；便秘和拉稀交替发生，粪便上粘液、血丝；还会出现尿血、气喘等症状；慢性结膜炎自眼部流出粘性或者脓性分泌物，可使上下眼睑粘连；鼻端、耳朵、四肢内侧、背下有出血点或出血斑，指压不退色；神经症状主要表现在痉挛、磨牙、站坐不稳，足交叉，运动失调；随着病毒载量增加会造成母猪流产、木乃伊胎、畸形、死胎等。剖检可见全身性的出血点，皮肤、粘膜、各脏器表面及内部；皮下、腹腔积水；扁桃体肿大充血梗死，随着细菌入侵表现出化脓性炎症；淋巴结肿大出血；肺脏“大理石”样病变；脾脏肿大，边缘有梗死区；肾脏表面有出血点，横切也可见出血点；膀胱粘膜有针尖样出血点；盲肠瓣、回肠和结肠可见扣状溃疡面。1.4.2CSF抗原检测CSF抗原检测的优点是检测快速，灵敏度高。可通过对疑似CSFV样本制作冷冻切片，进行直接免疫荧光（FAT）观察，FAT通过带有荧光信号的多克隆抗体识别病毒，在荧光显微镜下观察，根据荧光信号来判断病毒的存在。病毒入侵21 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测宿主2天后就可通过对扁桃体进行FAT检测到CSFV。1.4.3CSFV病毒分离病毒分离是实验室研究CSFV最直接、准确的方法。目前已经有许多分离CSFV的方法被建立。分离CSFV最常用的细胞是猪肾细胞（PK-15）或者猪睾丸细胞（ST），可从病猪的肺脏、肾脏、脾脏等脏器以及血液中进行活病毒的分离。获得生长状态良好、性能稳定、滴度高的CSFV需要大量的人力和物力。并且步骤繁杂，成功率不高，短时间无法完成。1.4.4CSFV基因组检测反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是检测各种RNA病毒的常用实验室方法，其检测结果精准、特异性高、过程也不繁琐。目前，主要根据CSFV的E2、5’-UTR、Npro上的特定序列设计引物。套式PCR的检测结果特异性更高，通过外套扩增富集目的片段的载量，在通过内套PCR扩增特定目的片段更容易。22 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测第二篇研究内容第一章疑似CSFV样本检测本实验室主要进行猪瘟病毒和狂犬病毒的分子生物学研究。采集的疑似猪瘟样本由佛山科学技术学院的吕宗吉老师提供。2011年自广东省乐丛、深圳、南海3个猪场发生临床疑似猪瘟疫情，各猪场的30日龄仔猪中有个别猪表现出CSF临床症状，并有仔猪在此期间死亡。采集死亡仔猪肾脏组织样品用于实验室进行猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）RT-PCR检测。1.1材料1.1.1疑似CSF病料本实验用到的三份疑似CSFV病料样品均于2011年采集于广东省，采集死亡仔猪肾组织样品用于实验室检测。1.1.2试剂与耗材试剂公司TRIzolLSInvitrogenSuperScriptIIIFirststrandcDNAsynthesiskitInvitrogenAccuprime高保真聚合酶InvitrogenExTaq宝生物工程（大连）有限公司dNTPs宝生物工程（大连）有限公司DNAMarker宝生物工程（大连）有限公司凝胶回收试剂盒AxygenQIAGENDNA提取试剂盒QIAGEN1.1.4主要的仪器设备与耗材仪器设备公司凝胶成像系统UVITEC，美国PTC200PCR仪BIO-RAD，美国电子天平：BP121SSartorius，德国超低温冰箱ELT-13V-85V28HARRIS，美国23 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测台式高速离心机Eppendorf，德国DK-8D型电热恒温水槽上海一恒科技有限公司GES水平电泳槽WEALTEC，美国1.1.5试剂配制50×TAE电泳缓冲液：242gTrisbase，18.6gEDTA，加800ml蒸馏水，于磁力搅拌器上混匀，加57.1ml冰醋酸。调节PH至8.0，加蒸馏水定容至1L。室温保存备用，使用前用蒸馏水稀释成1×TAE。1.0%琼脂糖凝胶：称1.0g琼脂糖至锥形瓶中，加入100ml1×TAE，微波炉加热至琼脂糖完全溶解，加入溴化乙锭5µl，摇匀后倒入模具中，插上梳子，待胶冷却凝固后取出使用。1.1.6引物设计与合成1.1.6.1CSFV检测用引物CSFV检测使用2002年版欧盟猪瘟诊断手册中推荐的用于CSF诊断以及以E2基因进行基因分型研究的套式RT-PCR引物，引物在吉林库美生物有限公司成。外套引物为：CSFV-WF：5’AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA3’2228～2250CSFV-WR：5’TTYACCACTTCTGTTCTCA3’2898～2880内套引物为：CSFV-NF：5’TCRWCAACCAAYGAGATAGGG3’2477～2497CSFV-NR：5’CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC3’2748～27261.1.6.2外源病毒检测引物猪蓝耳病病毒（PRRSV）检测引物由哈尔滨兽医研究所设计，通过扩增NSP2基因进行区分经典毒株和高致病性毒株：PRRSV237(18)：5’CGGAAGAAACTGTCGGTG3’PRRSV422(18)：5’CGCAGACAAATCCAGAGG3’猪圆环病毒2型（PCV-2）检测引物为哈尔滨兽医研究所设计用于检测PCV-2的套式引物：PCV-2检测外套引物（481bp）PCV-2-WF：5’CGGATATTGTAGTCCTGGTCG3’PCV-2-WR:5’ACTGTCAAGGCTACCACAGTCA3’PCV-2检测内套引物（225bp）PCV-2-NF：5’GATTGTATGGCGGGAGGAGT3’PCV-2-NR：5’ATTGACGACTTTGTTCCCCC3’24 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测1.1.7生物信息学分析软件引物设计软件：PrimerPremier5.0；序列分析软件：DNAStar软件包；序列比对软件：NCBIBLAST；系统进化分析软件：MEGA6.06。1.2方法1.2.1疑似CSF样本检测1.2.1.1CSFV总RNA提取（1）取肾组织样品1g左右剪碎，加1mlMEM研磨成匀浆备用；（2）取前处理研磨肾组织样品200μL，加到1.5mL的Eppendorf管中，在加入1mLTRIzolLS，混匀，室温静止10min；（3）向Eppendorf管中加入200μL氯仿，强烈震摇15s，室温静止10min，12000r/min4℃离心10min；（4）小心吸取上清至另一洁净Eppendorf管中，加等体积异丙醇，-20℃静止20min；（5）12000r/min4℃离心10min，小心弃掉上清；（6）加入750μL75%乙醇，7500r/min4℃离心6min，小心弃掉上清，倒置于吸水纸上沾干残余液体；（7）溶于20μL无RNA酶水中，-80℃保存备用。注意：RNA提取所用试剂、枪头等均无RNA酶污染，实验应佩戴一次性手套和口罩。1.2.1.2第一链cDNA的合成使用SuperScript®III第一链合成系统能够提供高质量的cDNA:（1）向1.5mL无RNA酶的Eppendorf管中加入：RNA样品2μL（10pg-5μgtotalRNA）1μL10mMdNTPMix(10mMeachdATP,dGTP,dCTP,dTTPatneutralpH)1μLrandomprimers(或特异性下游引物)6μL无RNA酶H2O（2）混匀管内样品，于65℃5min，立即放置于冰上冰浴1min。（3）准备cDNAmix：在新的1.5mL的Eppendorf管中加入4μL5XFirst-strandBuffer1μL0.1MDTT1μLRNaseOUTTMRecombiantRNaseInhibitor(Cat.No.10777-019,40units/μL)TM1μLSuperscriptIIIRT(200units/μl)**如果合成的cDNA超过5kb，那么接下来在50℃延伸是需要使用特异性下游引25 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测TM物，同时，SuperscriptIIIRT的用量需要提高至400U（2μL）（4）混匀Mix，全部加入到刚冰浴过的Eppendorf管中，如果使用的是randomprimers，则需要将Eppendorf管放置在25℃，5min（5）50℃延伸30-60min.如果使用特异性引物或者具有复杂结构的片段则需要把温度提高至55℃（6）70℃，15min中止反应（8）至此，cDNA已可以用于PCR扩增，如果PCR扩增长度超过1kb，则需要去除cDNA中的残留RNA干扰，加入1μ（L2units）E.coliRNaseH,37℃20min。1.2.1.3套式PCR扩增以反转录获得的cDNA为模板，利用ExTaqDNA聚合酶对CSFVE2部分基因组进行套式PCR扩增。外套PCR扩增体系为：2+10×EX-Taqbuffer（MgPlus）5.0µldNTPs（2.5mmol/Leach）4.0µlCSFV-WF2.0µlCSFV-WF2.0µlcDNA2.0µlEX-Taq1.0µlddH2O35.0µl外套PCR反应条件为：94℃，5min；30个循环（94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s）；72℃，10min。内套PCR扩增体系为：2+10×EX-Taqbuffer（MgPlus）5.0µldNTPs（2.5mmol/Leach）4.0µlCSFV-WF2.0µlCSFV-WF2.0µl外套产物2.0µlEX-Taq1.0µlddH2O35.0µl内套PCR反应条件为：94℃，5min；30个循环（94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s）；72℃，10min。内套PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切取目的条带，利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化的PCR产物送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。1.2.2外源病毒检测26 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测1.2.2.1QIAGEN试剂盒提取CSFV基因组总DNA（1）取20µlQIAGEN蛋白酶（或者蛋白酶K）至1.5mlEppendorf管。（2）加入200µl组织研磨液。若样品体积不够200µl，用PBS补足。（3）加入200µlBufferAL至样品中，涡旋振荡15s混匀。（4）56℃孵育10min。延长孵育时间得率也不会进一步提高。（5）瞬离，去除残留在1.5mlEppendorf管盖中的残留液滴。（6）加入200µl的96-100%乙醇，涡旋振荡15s混匀后瞬离。（7）将6中得到的混合物转移至QIAampMini离心柱，6000g离心1min。将QIAampMin离心柱放入一个洁净2ml接收管中，弃滤液。（8）向QIAampMini离心柱中加入500μlBufferAW1，6000g离心1min。将QIAampMini离心柱转移至一个洁净2ml收集管中，弃滤液。（9）向QIAampMini离心柱中加入500μlBufferAW2，,20000g离心3min。（10）将QIAampMini离心柱转移到一个洁净2ml收集管。20000g离心1min。（11）将QIAampMini离心柱转移到一个洁净1.5ml收集管。小心打开离心柱，加入200μlBufferAE或双蒸水。室温孵育1min，然后6000g离心1min。1.2.2.2PRRSV的检测PRRSV是单股正链RNA病毒，不同分离株之间的基因组存在广泛的差异，尤其是在ORF1a的nsp1b和nsp2，ORF3和ORF5的变异性很大。nsp2的变异主要表现在氨基酸的缺失，高致病性PRRSV是PRRSV的nsp2缺失30个氨基酸的变异株引起的。检测所用引物根据nsp2基因设计，可区分PRRSV高致病株和低致病株，扩增片段大小分别为：经典毒株293bp，高致病株203bp。以前文所得cDNA为模板，PCR反应体系为：2+10×EX-Taqbuffer（MgPlus）5.0µldNTPs（2.5mmol/Leach）4.0µlCSFV-WF2.0µlCSFV-WF2.0µlcDNA2.0µlEX-Taq1.0µlddH2O35.0µlPCR反应条件为：94℃，5min；30个循环（94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s）；72℃，10min。1.2.2.3PCV-2的检测PCV为单股环状DNA病毒，有两个血清型，PCV1和PCV2。PCV1为非致病性病毒，PCV2为致病性的病毒。以2.2.2.1所得DNA为模板，套式PCR检27 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测测反应体系为：2+10×EX-Taqbuffer（MgPlus）5.0µldNTPs（2.5mmol/Leach）4.0µlCSFV-WF2.0µlCSFV-WF2.0µlDNA2.0µlEX-Taq1.0µlddH2O35.0µl外套PCR反应条件为：94℃，5min；30个循环（94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s）；72℃，10min。以内套产物为模板进行外套PCR反应：2+10×EX-Taqbuffer（MgPlus）5.0µldNTPs（2.5mmol/Leach）4.0µlCSFV-WF2.0µlCSFV-WF2.0µl内套产物2.0µlEX-Taq1.0µlddH2O35.0µl内套PCR反应条件为：94℃，5min；30个循环（94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s）；72℃，10min。将检测的PRRSV，PCV-2的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切取目的条带，利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化的PCR产物送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。1.3.结果1.3.1疑似CSF样本检测结果CSFV检测采用欧盟猪瘟诊断手册推荐使用套式PCR检测方法，对来自广东省的3份疑似猪瘟病料（肾脏组织）进行CSFV核酸检测，CSFVE2部分基因套式RT-PCR扩增的内套PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳可见约271bp的DNA条带，其与预期大小相一致，表明该临床疑似样品为CSFV阳性。内套PCR产物核酸电泳结果见图5。基于E2基因片段的多序列比对表明三株流行毒株分别属于CSFV2.1b、CSFV2.1c、CSFV2.1d基因亚亚型。为此，我们分别将这三株流行毒株命名为GD176、GD53、GD19。28 吉林林农业大学硕士士学位论文第一章疑疑似CSF样本检检测M－+123200bp图5疑似CSF套式RT-PCR检测结果Fig.5TheresultofCSFnestedRT-PCRM：DL2000；－：阴性对照；1：GD176；2：GD53；3：GD19；+：阳性独照1.3.2外源病毒检测结果为了进一步检测CSF是否与猪其它常见病存在混合感染情况，我们对PRRSV，PCV-2两种猪常见的病原体进行了检测，PCR结果显示：3份CSF样品均未存在PRRSV感染，而PCV-2核酸检测均为阳性。1.3.2.1PRRSV检测结果M123+－200bp图6.PRRSVRT-PCR检测结果Fig.6TheresultofCSFRT-PCRM：DL2000；－：阴性对照；1：GD176；2：GD53；3：GD19；+：阳性独照1.3.2.2PCV-2检测结果123+－M200bp图7.PCV-2RT-PCR检测结果Fig.7TheresultofPCV-2RT-PCRM：DL2000；－：阴性对照；1：GD176；2：GD53；3：GD19；+：阳性独照29 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测1.4讨论CSF是世界范围内严重威胁养猪业的重大传染病，一旦暴发，通常会造成严重的经济损失。目前，由于CSF流行在有些国家和地区得到有效控制，有些国家已宣布彻底消灭了CSF，这也使得一些当年的流行毒株成为历史，比如曾在欧洲流行的基因1.1亚型和曾在亚洲流行的3.3和3.4亚型，近年来已鲜有报道。然而，基因2型悄然成为在世界各地广泛流行的优势毒株。20世纪90年代欧洲许多国家曾暴发2.1亚型毒株引起的CSF疫情，而近年来的报道则以2.2亚型和2.3亚型居多。在我国，最早的CSF疫情要追溯到上个世纪20年代，自1954年我国成功研制出猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)并推广应用至今,在我国控制CSF疫情上已取得显著效果。目前该疫苗仍然是世界上最有效并且应用范围最广泛的CSF疫苗。以HCLV免疫为基础,我国在1956年提出了消灭CSF规划,到现在58年过去了,CSF在我国仍然不间断流行,消灭CSF仍有一段路要走。目前在我国主要流行毒株是2.1型毒株。由于CSF是一种高度接触性传播的烈性传染病，CSFV的流行呈现出明显的地区特征。本研究通过从来自广东三个猪场的三份疑似CSF样品根据欧盟CSF诊断手册推荐的套式RT-PCR检测方法进行了RT-PCR检测，三份均为CSFV阳性，分别为2.1b亚亚型的GD176，2.1c亚亚型的GD53和2.1d亚亚型的GD19。由此可见，在我国广东省2.1亚型毒株也是主要流行毒株。为了清楚是否存在CSFV和其他病毒混合感染的情况，对3份阳性样品进行了PRRSV以及PCV-2两种猪的常见病毒的检测，结果发现三份样品均不存在PRRSV感染，而PCV-2均呈阳性。这说明在我国CSFV和PCV-2存在严重的混合感染本研究分离获得的CSFV2.1b亚亚型毒株GD176、2.1c亚亚型毒株GD53和2.1d亚亚型毒株GD19均采集自广东省，然而由于广东省地理位置特殊，与广西、江西、福建、湖南和海南五省相交，与台湾海峡一衣带水、隔海相望，与泰国、老挝等东南亚国家毗邻接壤，与香港特别行政区和澳门特别行政区咫尺之遥，而香港和澳门特别行政区是大陆与欧洲国家等对外进出口交流的窗口。本实验的来源猪场仔猪均从邻近的广西壮族自治区引进，这表明此次CSF疫情很有可能从广西经仔猪传播而来。因此，严格对跨境动物运输和贸易进行检验检疫，防止CSFV跨省乃至跨境传播，从而有效地控制病毒的流行。1.5小结1.通过套式RT-PCR对来自广东省的三份疑似CSF样品检测均呈CSFV阳性。2.为了检测是否还有其他病毒混合感染，对三份病料进行了PRRSV和PCV-2的检测，结果显示，3份样品均呈PRRSV阴性，而PCV-2均为阳性，这说明在30 吉林农业大学硕士学位论文第一章疑似CSF样本检测我国广东省部分猪场存在CSFV和PCV-2的混合感染。31 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代由于基因2型毒株在世界各地区广泛流行，其在应对环境选择压力方面与其它基因型毒株相比更有优势，因此，获得纯化且适应细胞的病毒株对进一步了解基因2型毒株的复制特性和毒力等非常必要。其次，我国猪瘟研究缺乏高培养滴-6度的细胞适应毒株，常用的石门毒在细胞上的TCID50通常不超过10，难以满足相关基础研究。因此，本实验对检测到的2.1b亚亚型毒株GD176、2.1c亚型毒株GD53和2.1亚型毒株GD19进行了体外细胞分离和细胞适应性传代，成功获得了高滴度的细胞适应毒。2.1材料2.1.1毒株采集自广东省的三份猪瘟阳性样品肾组织。2.1.2试剂与耗材试剂公司小牛血清GibcoMEMSigmaFITC标记的羊抗鼠IgGSigma伊文斯兰SigmaM199Gibco2.1.3细胞和抗体猪肾细胞系（PK-15）；猪睾丸细胞系（ST）；猪石门血毒（shimen）；猪抗CSFV阳性血清（一抗）；FITC标记的羊抗鼠IgG（二抗）。2.1.4主要的仪器设备与耗材仪器设备公司凝胶成像系统UVITEC，美国二氧化碳培养箱Thermo，美国倒置荧光显微镜：Axioskop40ZEISS，德国生物安全柜：ClassⅡThermo，美国电子天平：BP121SSartorius，德国32 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代超低温冰箱ELT-13V-85V28HARRIS，美国台式高速离心机Eppendorf，德国2.1.5培养基和溶液配制MEM与M199细胞生长液：10%牛血清；1%双抗（青链霉素）；1%谷氨酰胺，现配现用。MEM与M199细胞维持液：2%牛血清；1%双抗；1%谷氨酰胺，现配现用。10×PBS（pH7.4）贮存液：称取Na2HPO4·12H2O58.0g，NaCl160.0g，KH2PO44.0g，KCl4.0g，加1500mL蒸馏水，充分溶解后，将其定容至2L，调PH值至7。高压灭菌后放于室温保存。丙酮固定液：将分析纯丙酮利用蒸馏水配制成80%丙酮固定液，-20℃保存。IFA一抗稀释液：用含10%小牛血清1×PBS对猪抗CSFV高免血清做200倍稀释。（注：猪抗CSFV血清为勃林格公司惠赠）。IFA释液：用含10%小牛血清1×PBS将FITC标记的兔抗猪IgG稀释100倍，按体积比（1/8000）加入伊文斯兰。2.1.6引物设计与合成2.1.6.1CSFVE2全长套式引物E2全长外套引物为：CSFV-E2-WF：5’-CAGCTSAAYCTAACAGTRGRAC-3’CSFV-E2-WR：5’-CRCTRAYCATBAGCAAYGCYACYG-3’E2全长内套引物为：CSFV-E2-NF：5’-GGYRAATATGTGTGTGTWAGACC-3’CSFV-E2-NR：5’-TGGTCTTRACTGGRTTGTTRGTC-3’2.1.6.2BVDV检测套式引物BVDV检测外套引物（280-284bp）Pl03F：5’TAGCCATGCCCTTAGTAGGACT3’（103-124NADL）P365R：5’TGTGCCATGTACAGCAGAGATT3’（386-365NADL）BVDV检测内套引物（191bp）Bl45F：5’AACAGTGGTGAGTTCGTTGGAT3’（145-166NADL）B314R：5’CACCCTATCAGGCTGTATTCGT3’（335-314NADL）2.1.7生物信息学分析软件引物设计软件：PrimerPremier5.0；序列分析软件：DNAStar软件包；序列比对软件：NCBIBLAST；系统进化分析软件：MEGA6.06。33 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代2.2方法2.2.1CSF阳性样本制备分别取约0.2g的CSFV2.1亚型毒株GD176、GD53和GD19的肾组织样品于玻璃研磨器中，滴加1mL无双抗无血清的MEM充分研磨成匀浆，转移至1.5mL离心管，4℃12000r/min离心10min，0.22μm滤器过滤除菌，-80℃保存备用。2.2.2PK-15细胞培养与传代选生长状态良好的PK-15细胞，用含10%胎牛血清MEM细胞培养生长液，进行细胞传代，于37℃，5%CO2温箱培养24h后，换用含胎牛血清5%MEM细胞培养维持液，继续培养48h后传代。用胰酶将PK-15细胞从细胞培养瓶上消化下来后，加入10%胎牛血清MEM细胞培养生长液，用弯头吸管反复吹打均匀后，按照1:5的比例传至T25细胞培养瓶中继续培养。（1）PK-15细胞用培养维持液培养48h后，用移液管吸去培养瓶中的旧培养液。（2）加1mL胰蛋白酶，轻轻晃动培养瓶数次，使消化液覆盖所有细胞表面，弃掉消化液。（3）再次加入1mL胰蛋白酶，放置于37℃CO2培养箱消化5-8min，在倒置显微镜下观察，当细胞间隙增大或细胞收回突起变圆后应立即终至消化。（4）倒掉消化液，加入9mL细胞生长液，用弯头滴管反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。（5）计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养瓶中培养。2.2.3接毒（1）待单层细胞生长至80%满度，弃去培养瓶中的培养液，加1mL无血清无双抗的MEM洗涤2次，弃掉剩余的培养液。（2）取过滤后的CSFV2.1b亚型毒株GD176、GD53和GD19的肾组织研磨液上清200µl，用双无MEM将其稀释至1mL，加到细胞培养瓶中，于37℃，5%CO2恒温箱中感作1.5h，在这其间，将培养瓶轻轻摇晃2次，使单层细胞能够充分吸附病毒粒子。（3）弃掉感作液，加2mL双无MEM，洗涤2次，除去杂质，以免影响细胞正常生长。（4）加入细胞维持液，置于37℃，5%CO2恒温箱中继续培养72h。2.2.4CSFV流行毒株细胞适应性传代为了提高CSFV在PK-15细胞上的适应性，将制备的肾组织悬液接种于80%满度的单层PK-15细胞进行细胞适应性传代。实验采用感染细胞带毒传代（带毒传代）和病毒培养物接种正常细胞（接毒传代）相结合的方法交替进行。首先34 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代利用带毒传代进行病毒的细胞传代适应。当病毒感染细胞达到90%以上时，带毒传代的细胞培养物通过反复冻融进行收集，然后将其接种正常PK-15细胞，感染后96h收集病毒细胞培养物以进行下一轮的接毒传代培养直至病毒基本适应细胞。2.2.5CSFV流行毒株间接免疫荧光鉴定带毒传代的同时，将胰酶消化的病毒感染细胞悬液接种到96孔板中，培养72h后利用CSFVE2特异性单抗WH303和FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光试验（Indirectfluorescentantibodyassay，IFA）以监测病毒感染和增殖情况。2.2.5.1感染CSFV的细胞固定与染色（1）将胰酶消化的病毒感染细胞悬液接种到96孔板中，培养72h后，轻轻弃掉培养板中培养基；（2）用1×PBS清洗培养板2-3次，200μl/孔。每孔加入50μl80%冷丙酮于-20℃固定60min。（3）弃掉丙酮，用1×PBST（0.05%Tween20的PBS）清洗培养板3次，每次孵育5min。（4）加入稀释后的一抗，每孔50μl，放置于37℃温箱中感作1h；（5）用PBST清洗培养板3次，每次孵育5min。（6）加入稀释过的二抗,，每孔50µl，避光放置于37℃温箱中感作1h；（7）用PBST清洗培养板3次，洗掉没结合的二抗，每次5min。（8）在吸水纸上轻轻将孔内残留液体加入封固液（80%甘油的PBS缓冲液），每孔50µl，将96孔板倒置在Axioskop40(ZEISS，德国)正置荧光显微镜下，使用10×物镜进行荧光观察。感染CSFV的细胞胞质可见明亮的翠绿色荧光，而正常细胞呈现暗红色。实验将感染石门毒的细胞设为阳性对照，正常的细胞设为阴性对照。2.2.5.2病毒滴度(TCID50)的测定为了观察每个代次病毒的滴度，评价CSFV的细胞传代适应性，将传代过程-6中不同代次的细胞上清接种到96孔板中，进行10×梯度稀释至10，每一稀释度6个重复，培养72h后利用IFA监测病毒的感染情况。使用Kärber公式计算细胞病毒液的TCID50。Kärber公式为：lgTCID50=L-d(s-0.5)其中，L=最高稀释度的对数；d=稀释对数之间的差；s=阳性孔比率总和。2.2.5.3CSFV2.1亚型毒株E2全长扩增为了分析CSFV流行毒株GD176、GDD53、GD19在PK-15细胞的传代适35 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代应性是否会导致与细胞感染相关的病毒蛋白基因发生变异，实验对CSFV流行毒株GD176、GDD53、GD19原始肾组织毒（CSFVGD176-F0、GDD53-F0、GD19-F0）和多个代次细胞适应毒（F6、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40、F46）的E2全长基因进行了扩增和序列分析。以2.2.1.2中的方法制备cDNA，CSFV-E2内外套引物进行套式PCR扩增。PCR体系为：2+10×EX-Taqbuffer（MgPlus）5.0µldNTPs（2.5mmol/Leach）4.0µlCSFV-WF2.0µlCSFV-WF2.0µlDNA2.0µlEX-Taq1.0µlddH2O35.0µl外套PCR反应条件为：94℃，5min；30个循环（94℃，30s；55℃，30s；72℃，2min）；72℃，10min。以内套产物为模板进行外套PCR反应：2+10×EX-Taqbuffer（MgPlus）5.0µldNTPs（2.5mmol/Leach）4.0µlCSFV-WF2.0µlCSFV-WF2.0µl内套产物2.0µlEX-Taq1.0µlddH2O35.0µl内套PCR反应条件为：94℃，5min；30个循环（94℃，30s；55℃，30s；72℃，90s）；72℃，10min。内套PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切取目的条带，利用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化，纯化的PCR产物送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。2.2.6CSFV细胞适应毒生长动力学曲线为了进一步确定细胞适应毒的生长特性，将GD176-F46细胞毒、GD53-F46细胞毒、GD19-F46细胞毒以0.1MOI感染量接种24孔板中的PK-15细胞，在感染后12h、24h、36h、72h和96h收集病毒培养物，反复冻融3次后进行病毒TCID50滴度测定。2.3结果2.3.1CSFV流行毒株分离结果36 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代使用PK-15细胞分别从经套式RT-PCR检测呈CSFV阳性的猪肾脏组织中进行CSFV分离。将病料研磨匀浆离心，上清接种PK-15细胞后按照正常细胞传代的方法，带毒传至第5代（F5），每代带毒传代的细胞使用间接免疫荧光（IFA）的方法对CSFV流行毒株进行鉴定，在倒置荧光显微镜下可观测到翠绿色荧光，且这种荧光在细胞带毒传代的过程中呈动态变化，可与不能增殖的非特异性荧光相区别开，以此作为分离出CSFV的标志。我们使用PK-15细胞分离出3株CSFV流行毒株（IFA结果见后图)。通过病毒分离，为今后研究我国广东省猪瘟病毒流行毒株分子生物学特性积累了宝贵的生物学材料。2.3.2BVDV检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）与CSFV同属于黄病毒科，瘟病毒属，全基因组序列具有较高的同源性，因此CSFV可能与其它瘟病毒属成员存在着血清学交叉反应，检测CSFV的IFA使用的一抗为猪抗shimen血毒阳性血清的多克隆抗体，通过IFA很难区分出BVDV与CSFV。然而，可以通过套式RT-PCR技术对BVDV进行核酸检测进行区分。因此，有必要对分离出的CSFV流行毒株进行BVDV核酸检测。BVDV套式RT-PCR检测结果显示，三株CSFV分离株GD176、GD53、GD19均为BVDV阴性，PCR鉴定结果见图7，由此说明分离出的流行毒株均为CSFV。M+123－图8牛病毒性腹泻病毒PCR检测结果Fig.8ThePCRresultofBVDVM．MarkerDL2000；＋：阳性对照；1：GD176；2：GD53；3：GD19；－：阴性对照2.3.3CSFV流行毒株体外细胞传代适应实验利用带毒传代的方法对广东CSFV流行毒株GD53，GD176和GD19在PK-15细胞上进行了适应性传代。这3个毒株已经在细胞上进行了46次带毒传代，前18代（F18）利用带毒细胞进行传代，从第19代(F19)开始，利用带毒细胞与正常细胞混合培养的方式进行带毒传代。除了F1代和F3代外，其它代次的病毒感染细胞都进行了IFA检测。结果显示，随着传代次数的增加，病毒感染细胞的数目逐步增多，到F11代（GD53和GD19）或F13代（GD176）时，90%以上的细胞感染了病毒，见附图。在此基础上继续37 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代进行带毒传代，病毒感染的细胞数目稍有增加，但荧光强度确有所下降。此外，在F15代时，除了GD53外，其它2株病毒在感染细胞数目或荧光强度方面与F13代以上的代次比较时明显下降，但F16代恢复正常。由于GD53和GD19在F11代时90%以上的细胞感染了病毒，因此，这2个毒株从F12代开始到F15代，除了正常带毒传代之外，还利用带毒细胞（1.5ml）与正常细胞（1.2ml）混合培养的方法进行传代。结果发现，在加入正常细胞后，混合培养的感染细胞数目与正常带毒传代（只有病毒感染细胞）时基本一致，在显微镜下观察时，前者的荧光强度比后者更强，这可能是由于在病毒感染达到高峰后继续进行带毒传代，细胞的正常代谢会发生很大变化，而加入正常细胞后在一定程度上改善了细胞的状态。这些结果表明带毒细胞与正常细胞混合培养的带毒传代方法既保证了病毒的继续带毒传代，又有助于保持细胞的状态。为此，从F16代到F18代，这3个毒株也进行了带毒细胞和正常细胞混合培养的带毒传代。从F19代开始，带毒传代采用1ml带毒细胞和1ml正常PK15细胞混合培养方式进行传代至24代，然后采用接毒传代至46代。2.3.3.1CSFVGD176体外细胞传代适应实验利用带毒传代和接毒传代相结合的方法对GD176在PK-15细胞进行了连续传代适应。通过将病毒感染细胞连续传代至F18，将反复冻融收集的F18细2.61胞培养物接种正常细胞，按此方法继续接毒传代至F46，病毒滴度从108.06TCID50/mL（F6）提高至10TCID50/mL（F46），表明实验获得了高度适应细胞的GD176细胞毒（附1）。在带毒传代过程中，病毒滴度随着代次增加而逐步增加，但从F9开始至F18病毒滴度没有明显增加，此时，将F18细胞培养物接种正常细胞进行接毒传代后，病毒滴度明显增加，至F46病毒滴度达到较高水平，此时GD176已经适应PK-15细胞。为测定GD176-F46细胞适应毒的增殖动力学特性，以0.1MOI病毒接种PK-15细胞，收集感染后不同时间点的病毒培养物进行TCID50测定，结果显示接种后12h至36h病毒复制速度较快，病毒滴度呈指8.17数增长，至72h病毒滴度达到峰值（10TCID50/ml）（图10）。38 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代图9.CSFVGD176不同代次病毒滴度Fig.9VirusstocksofdifferentgenerationsofGD176图9对不同代次GD176的病毒培养物进行10倍梯度稀释，分别接种于96孔板培养的单层PK-15细胞，每个稀释度设6孔，于37℃5%CO2下培养72h后进行IFA。每一代次细胞毒的滴度为3次独立实验结果的平均值。图10CSFV细胞适应毒GD176-F46生长动力学曲线Fig.10Growthcharacteristicsofcell-adaptedCSFVGD176图10将GD176-F46细胞毒以MOI=0.1接种培养在24孔板中的PK-15细胞，在感染后不同时间收集病毒培养物，反复冻融3次后进行病毒滴度测定。病毒感染后每一时间点收集样品的滴度为3次独立实验结果的平均值。2.3.3.2CSFVGD53体外细胞传代适应实验利用带毒传代和接毒传代相结合的方法对GD53在PK-15细胞进行了连续传代适应。通过将病毒感染细胞连续传代至F18，将反复冻融收集的F18细胞培养物接种正常细胞，按此方法继续接毒传代至F46，病毒滴度从39 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代3.398.510TCID50/mL（F6）提高至10TCID50/mL（F46），这说明实验获得了高度适应细胞的GD53细胞毒（图11）。在带毒传代过程中，病毒滴度随着代次增加而逐步增加，但从F9开始至F18病毒滴度没有明显增加，此时，将F18细胞培养物接种正常细胞进行接毒传代后，病毒滴度明显增加，至F46病毒滴度达到较高水平，此时GD53已经适应PK-15细胞。为测定GD53-F46细胞适应毒的增殖动力学特性，以0.1MOI病毒接种PK-15细胞，收集感染后不同时间点的病毒培养物进行TCID50测定，结果显示接种后12h至36h病毒复制速度较快，病毒8.38滴度呈指数增长，至48h病毒滴度达到峰值（10TCID50/mL）。1098/ml5076Log10TCID543F6F9F18F24F35F40F46PassageofGD53/2011图11CSFVGD53不同代次病毒滴度Fig.11VirusstocksofdifferentgenerationsofGD53图11对不同代次GD53的病毒培养物进行10倍梯度稀释，分别接种于96孔板培养的单层PK-15细胞，每个稀释度设6孔，于37℃5%CO2下培养72h后进9行IFA。每一代次细胞毒的滴度为3次独立8实验结果的平均值。/ml5076Log10TCID5404020406080100120Postinfection(hour) 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代图12CSFV细胞适应毒GD53-F46生长动力学曲线Fig.12Growthcharacteristicsofcell-adaptedCSFVGD53图12将GD53-F46细胞毒以MOI=0.1接种培养在24孔板中的PK-15细胞，在感染后不同时间收集病毒培养物，反复冻融3次后进行病毒滴度测定。病毒感染后每一时间点收集样品的滴度为3次独立实验结果的平均值。2.3.3.3CSFVGD19体外细胞传代适应实验利用带毒传代和接毒传代相结合的方法对GD19在PK-15细胞进行了连续传代适应。通过将病毒感染细胞连续传代至F18，将反复冻融收集的F18细胞培养物接种正常细胞，2.547.88按此方法继续接毒传代至F46，病毒滴度从10CID50/mL（F6）提高至10TCID50/mL（F46），表明实验获得了高度适应细胞的GD19细胞毒（附3）。在带毒传代过程中，病毒滴度随着代次增加而逐步增加，F9至F18病毒滴度依然没有明显增加，此时，将F18细胞培养物接种正常细胞进行接毒传代后，病毒滴度明显增加，至F46病毒滴度达到较高水平，此时GD19已经适应PK-15细胞。为测定GD19-F46细胞适应毒的增殖动力学特性，以0.1MOI病毒接种PK-15细胞，收集感染后不同时间点的病毒培养物进行TCID50测定，结果显示接种后12h至36h病毒复制速度较快，病毒滴度呈指数增长，至72h病毒滴度达到峰值7.88（10TCID50/mL）。41 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代图13CSFVGD19不同代次病毒滴度Fig.13VirusstocksofdifferentgenerationsofGD19图13对不同代次GD19的病毒培养物进行10倍梯度稀释，分别接种于96孔板培养的单层PK-15细胞，每个稀释度设6孔，于37℃5%CO2下培养72h后进行IFA。每一代次细胞毒的滴度为3次独立实验结果的平均值。图14CSFV细胞适应毒GD19-F46生长动力学曲线Fig.14Growthcharacteristicsofcell-adaptedCSFVGD19图14将GD19-F46细胞毒以MOI=0.1接种培养在24孔板中的PK-15细胞，在感染后不同时间收集病毒培养物，反复冻融3次后进行病毒滴度测定。病毒感染后每一时间点收集样品的滴度为3次独立实验结果的平均值2.3.4CSFV流行毒株不同代次细胞毒E2全长基因组序列测定为了分析GD176、GD53、GD19在PK-15细胞的传代适应性是否会导致与42 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代细胞感染相关的病毒蛋白基因发生变异，实验对CSFV原始肾组织毒（CSFV-F0）和多个代次细胞适应毒的E2全长基因进行了扩增和序列分析。结果表明三个流行毒株的CSFV-F0的E2基因序列与F6、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40和F46细胞毒的E2基因核苷酸序列完全一致，该结果说明GD176E2蛋白在PK-15细胞传代过程中未发生变异。另外，细胞适应毒中未检测到PCV-2，在传代过程中已被筛选掉。2.3.5CSFV流行毒株不同代次细胞毒Erns全长基因组序列测定然而为检测细胞传代适应是否导致GD176、GD53和GD19的其他基因的变rns化，本实验还对F0和F46代的E基因进行了分析，结果发现三株2.1亚型毒株的F0与F46相比，位于多聚蛋白第476位氨基酸残基均由丝氨酸（Ser）突变成精氨酸（Arg），这可能与病毒适应宿主细胞密切相关。2.4讨论由于2.1亚型毒株在世界各地区广泛流行，其在应对环境选择压力方面与其它基因型毒株相比更有优势，因此，获得纯化且适应细胞的病毒株对进一步了解基因2型毒株的复制特性和毒力等非常必要。其次，我国猪瘟研究缺乏高培养滴-6度的细胞适应毒株，常用的石门毒在细胞上的TCID50通常不超过10，难以满足相关基础研究。因此，本实验对检测到的2.1b亚亚型毒株GD176，2.1c亚型毒株GD53和2.1d亚型毒株GD19进行了体外细胞分离和细胞适应性传代，成功获得了高滴度的细胞适应毒。实验开始阶段对原始肾组织研磨液同时进行了带毒传代和接毒传代培养，结果只有带毒传代成功分离获得了病毒，这可能是由于原始组织中病毒含量少以及病毒对细胞的适应能力差导致的。表明带毒传代从CSFV临床组织样品中进行病毒分离的成功率较高，这对其他病毒的分离培养也具有借鉴意义。实验通过将2.1亚型毒株在PK-15细胞上进行连续传代获得了高度适应细胞的病毒株实验对CSFV2.1亚型毒株GD176、GD53和GD19的不同代次（F0、F6、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40和F46）细胞毒的E2全长基因进行了扩增和序列测定，结果发现F0与F6、F10、F15、F20、F25、F30、F35、F40和F46的E2基因序列完全一致，这表明囊膜蛋白E2在病毒适应PK-15细胞过程中非常稳定。在传代过程中病毒比较稳定，未发生变异等情况。Hulst等报道CSFV可以与细胞表面带负电荷的硫酸乙酰肝素（Heparinrnssulfate，HS）结合从而进入细胞，位于多聚蛋白E上第476位Ser→Arg突变能使不带电荷的Ser突变成带正电荷的Arg，通过这种突变，病毒可以更好的吸附在细胞表面带负电荷的硫酸乙酰肝素上,进而增强了病毒的复制能力，这可能是GD176、GD53和GD19成功适应细胞并获得较高滴度的分子原因。43 吉林农业大学硕士学位论文第二章CSFV2.1亚型毒株体外细胞适应性传代2.5小结1.本研究对采集自广东省的CSFV流行毒株进行了检测和体外细胞分离培养，成功获得了高度适应PK-15细胞的2.1b亚亚型毒株GD176、2.1c亚型毒株GD53和2.1d亚型毒株GD19。并对本研究中获得的细胞适应毒的生长动力学进行了鉴定，这些病毒株有望成为CSFV感染和致病特性研究的标准毒株。2.获得的细胞适应毒株E2蛋白十分稳定；Erns上476位氨基酸残基均由丝氨酸（Ser）突变成精氨酸（Arg），这可能与病毒适应宿主细胞密切相关。44 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析CSFV全基因组长约13kbp，通常通过分段重叠的方法扩增全基因组序列，实验根据NCBI上已公布的2.1亚型毒株序列选择保守区域设计了7对含重叠区域引物，利用Accuprime高保真聚合酶成功扩增出了GD176、GD53和GD19基因组全长序列，这对研究2.1亚型毒株的基因结构特点、系统进化分析以及构建CSFV体外复制子模型奠定了基础。3.1材料3.1.1试剂与耗材试剂公司TRIzolLSInvitrogenSuperScriptIIIFirststrandcDNAsynthesiskitInvitrogenAccuprime高保真聚合酶InvitrogenDNAMarker宝生物工程（大连）有限公司凝胶回收试剂盒Axygen3.1.2引物设计与合成表2用于CSFV全长基因扩增的特异性引物Table2Specificprimersusedforamplifyingthefull-lengthgeneofCSFV引物名称序列(5'→3')位置扩增长度（bp）primersequence(5'→3')locationlength（bp）CSFV-1FGTATACGAGGTTAGTTCGTTC1-201889CSFV-1RGTATACGAGGTTAGTTCGTTC1871-1889CSFV-2FGGAGGCAACTCAGGACCACA1784-18042462CSFV-2RAGCCCACATCGTAAACACCA4225-4246CSFV-3FCCCAACTTTACCATCTCACA4102-41221671CSFV-3RTTTCCTTACCATCTCCGTCA5754-5773CSFV-4FAGTCGGAAGGGTCAAGGTCG5662-5681168145 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析CSFV4RTGATGGCATTCGGAGCGTAC7324-7343CSFV-5FAAACAGGTGGCTGGTCTATC7169-71881838CSFV-5RTTTATGGTCCCTATGTCTTCA9143-9162CSFV-6FTGAGAAACCCAACCACAAA8922-89411622CSFV-6RATTCCTCCCACTCCACAACG10525-10544CSFV-7FGCACAAGAAGTTGATGGAAG10462-104811834CSFV-7RGGGCCGTTAGGAAATTACCT12275-122963.1.3生物信息学分析软件引物设计软件：PrimerPremier5.0；序列分析软件：DNAStar软件包；序列比对软件：NCBIBLAST；系统进化分析软件：MEGA6.06。3.2方法3.2.1TRIzolLS/QIAGENRNeasy试剂盒组合提取CSFV总RNA（1）取CSFVGD176/GD53/GD19-F46细胞毒200μL，加到1.5mL的Eppendorf管中，在加入1mLTRIzolLS，混匀，室温静止10min；（2）向Eppendorf管中加入200μL氯仿，强烈震摇15s，室温静止10min，12000r/min4℃离心10min；（3）小心吸取上清至另一洁净Eppendorf管中，加等体积75%乙醇；（4）转移到RNeasy柱子（Qiagen）上，8000g离心1min，弃掉上清。（5）加700μLBufferRW1到RNeasyspincolumn，盖上管盖，8000g离心15s，清洗spincolumn膜，弃掉废液。（6）加入500μLBufferRPE到RNeasyspincolumn，盖上管盖，8000g离心15s，清洗spincolumn膜。弃掉废液。（7）加入500μLBufferRPE到RNeasyspincolumn，盖上管盖，8000g离心2min，清洗spincolumn膜，确保没有乙醇残留，以免影响下游反应。（8）将Rneasyspincolumn置于一个新的1.5ml无RNA酶Eppendorf管中，加入30μLRNase-freewater，盖上管盖，8000g离心1min洗脱RNA。（9）重复上一步，用30μLRNase-freewater分别洗脱4次。3.2.2CSFV流行毒株全长基因组分段扩增在实验中我们发现第三次洗脱下来的RNA进行RT-PCR效果最好，推测可能是由于其含有较高比例的全长基因组RNA,以第三次洗脱下来的RNA为模板，CSFV-7R为引物进行反转录。以获得的cDNA为模板，利用Accuprime高保真聚合酶和特异性引物进行全长基因组片段的扩增。PCR反应体系为：10XAccuPrime™PfxReactionmix5μl46 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析Primermix(10μMeach)2μlTemplateDNA2μlAccuPrime™PfxDNAPolymerase0.4μlAutoclaveddistilledwaterto50μlPCR反应条件为：94℃，30s；30个循环（94℃，15s；55℃，30s；68℃，2min）。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，阳性的PCR产物送至吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定，CSFV流行毒株全基因组序列测定进行了3个独立重复试验。3.2.3CSFV流行毒株全长基因组序列分析CSFV具有较大的遗传多样性，本课题通过不断优化各种反应体系和条件，分段扩增出CSFV流行毒株全长基因组，本部分在之前研究的基础上，用序列分析软件对测序结果进行整理、拼接，获得了CSFV全基因组序列，并在此基础上进行了系统进化分析及体外复制能力的初步预测，为下一步构建CSFV复制子的研究工作奠定了基础。利用DNAStar(version7.1,Lasergene）软件进行序列的编辑和拼接，由MEGA6.06软件，步展值检验（Bootstrap）1000次重复,遗传距离估算模型采用Kimura双参数法（Kimura2-parametermodel）模型，采用邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树。3.3结果3.3.1GD176全基因组序列分析为获得GD176-F46全基因组序列，本实验分7段对其进行了全长基因组扩增和测序，最后拼接获得了GD176-F46全基因组序列。GD176-F46基因组全长12295nt，包括一个大的ORF及两侧非翻译区5’-NTR（372nt）和3’-NTR（227nt）。ORF编码一个3898个氨基酸的多聚蛋白。GD176与2.1a亚亚型核苷酸和氨基酸同源性为91.8%~94.3%和94.9%~96.8%，与2.1c亚型的核苷酸和氨基酸同源性为90.9%~91.8%和95.2%~96.2%。然而，GD176与1.1亚型的代表株HCLV株和石门株的同源性较低，与HCLV株核苷酸及氨基酸同源性分别为82.5%和88.7%，与石门株核苷酸及氨基酸同源性分别为83.8%和90.3%。为了进一步分析GD176与其他2.1亚型毒株之间的差异，将各毒株的相应蛋白氨基酸序列分别进行了多序列比对，结果显示氨基酸同源性最低的蛋白是NS5A（87.1%~97.8%），其次是E2（88.7%~98.7%）和C蛋白（90.9%~96%）这些结果表明相对于其他2.1亚型病毒株，GD176多聚蛋白中NS5A的变异性最大。3.3.2GD53全基因组序列分析本实验分7段对GD53-F46进行了全长基因组扩增和测序，拼接获得了47 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析GD53-F46全基因组序列。GD53-F46基因组全长12296nt，包括一个大的ORF及两侧非翻译区5’-NTR（372nt）和3’-NTR（227nt）。ORF编码一个3898个氨基酸的多聚蛋白。GD53与2011年分离于湖南省的2.1c亚亚型的HNLY同源性最高，核苷酸和氨基酸同源性分别为98.8%和99.2%。GD53与其他2.1亚型的分析结果表明，其与2.1a型之间的同源性较高，核苷酸及氨基酸同源性分别为92.5%~93.9%和96.6%~97.4%，与2.1b亚型的核苷酸和氨基酸同源性较2.1a亚型略低，为92.3%~93.1%和96.3%~97.0%。然而，GD53与1.1亚型的代表株HCLV株和石门株的同源性较低只有84.1%和84.8%,这表明其不是来自于这两株毒株。病毒多聚蛋白序列分析表明GD53在病毒蛋白重要功能区非常保守，包括Erns的RNase活性位点，E2的半胱氨酸残基。正如所料，NS3-4A携带的蛋白酶、解旋酶以及ATP酶序列在疫苗株和流行株之间都很保守，这表明这个多聚蛋白在病毒复制过程中起着重要作用。为了进一步分析GD176与其他2.1亚型毒株之间的差异，将各毒株的相应蛋白氨基酸序列分别进行了多序列比对，结果显示氨基酸同源性最低的蛋白是NS5A（90.9%~93.9%），其次是E2（94.9%~97.6%）。这些结果表明相对于其他2.1亚型病毒株，在GD53的多聚蛋白中NS5A的变异性最大。3.3.3GD19全基因组序列分析为获得GD19-F46全基因组序列，本实验分7段对其进行了全长基因组扩增和测序，最后拼接获得了GD19-F46全基因组序列。GD19-F46基因组全长12298nt，包括一个大的ORF及两侧非翻译区5’-NTR（372nt）和3’-NTR（227nt）。ORF编码一个3898个氨基酸的多聚蛋白。GD19株形成一个有别于其他3个2.1亚亚型的进化支，为此，将其命名为2.1d。为了进一步确定系统进化分析的结果，实验对不同的基因2.1亚亚型之间的核苷酸同源性进行了分析，核苷酸分析结果表明该2.1d型毒株与21a型毒株间同源性为92.4%-93.6%，与2.1b型毒株间的同源性为88.4%-92.8%，与2.1c型HNLY2011同源性为91.7%，低于2.1a与2.1b之间的核苷酸同源性（91.2-95.8%），这些结果进一步证2.1d亚亚型划分的准确性。病毒多聚蛋白序列分析表明GD19在病毒蛋白重要功能区很保守，包括Erns的RNase活性位点，E2的半胱氨酸残基。为了进一步分析GD19与其他2.1亚型毒株之间的差异，将各毒株的相应蛋白氨基酸序列分别进行了多序列比对，结果显示氨基酸同源性最低的蛋白是NS5A（86.5%~88.5%），其次是E2（87.9%~89.8%）。这些结果表明相对于其他2.1亚型病毒株，在GD19的多聚蛋白中NS5A的变异性最大。3.3.4基于CSFV流行毒株E2基因系统进化分析CSFV只有1个血清型，因此，在核苷酸序列比较基础上对CSFV进行基因分48 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析型以追踪流行毒株来源和传播，了解病毒遗传变异的特征以及流行规律具有重要意义。目前常用于CSFV基因分型的基因组区段包括5’-UTR、E2和NS5B基因。基于猪瘟病毒流行毒株E2全长基因序列进行系统进化分析，从系统进化树的拓扑结构（图15）可以看出，表3用于CSFV2.1亚型系统发生分析的CSFV国内外参考毒株Tab.3DomesticandforeignCSFVisolatesandreferencestrainsemployedforevolutionaryanalysisofcompletegenome毒株采集地亚型分离年份GenBank登陆号Paderborn丹麦2.1a2002GQ90294196TD中国台湾2.1a2004AY554397SXCDK陕西2.1a2009GQ923951HNLY.2011湖南2.1c2011JX262391ZJ-08中国2.1b2008FJ529205HEBZ山西2.1b2009GU592790Hennef德国2.32009GU233733CSF864Jambu2.32007HQ148062Uelzen德国2.32004GU324242CSF0821Novska2.32002HQ148061Thiverval法国1.12008EU490425AlfortA19法国1.11997PTU90951CSF0382德国1.12010HM237795Shimen中国1.11998AF092448CF-114中国1.12001AF333000Brescia瑞士1.11998AF091661HCLV中国1.12002AF531433CAP瑞士1.11996X96550Brescia意大利1.21990M3176894-TWN中国台湾3.41994AY646427P97中国台湾3.41994L49347XJ-04BVDV中国2.1b2004FJ527854GXWZ02广西2.1b2002AY367767Heb2010陕西2.1b2010JQ268754PC11WB韩国2.1b2011KC14999149 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析*GD19广东2.1d2011本研究GD176广东2.1b2011本研究GD53广东2.1c2011本研究图15基于E2基因全长的CSFVGD176与CSFV其他参考毒株的系统进化树Fig.15Phylogenetictreebasedonthefull-lengthE2geneofCSFVsub-subgenotype2.1withotherCSFVisolates图15使用Mega6.06对GD176、GD53和GD19和GenBank上其他24株参考毒株的E2全长进行系统进化分析，进化树分析选择使用邻接法，bootstrap设为1000个重复。3.4讨论目前常用5’-UTR、E2和NS5B基因作为CSFV流行毒株的分型和系统进化分析，但这种方法不能完全准确的反应病毒之间的差异变化。为了清楚HCLV株和CSFV2.1亚型流行毒株之间基因水平上的差异，我们对GD176、GD53和GD19进行了全基因组测序分析。GD53全基因组为12296nt，GD176为12295nt，50 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析GD19为12298nt，所述详细信息见表4。基于全长基因组系统进化分析表明，GD176于其他5株毒株来自2.1b亚亚型，GD53于之前报道过的HNLY2011分离株位于2.1c亚亚型，而GD19形成了一个新的独立分支2.1d，这与之前报道rns过的相一致。通过E、E2、NS5A和NS5B对2.1亚型流行毒株进行系统进化分析所构建的系统进化树与应用全长基因组所构建的进化树相类似，而5’-UTR构建的系统进化树与其略有不同，其中2.1a亚型毒株SXCDK被分到2.1b亚型，而GD19则与2.1b亚型的GXWZ02分到一个分支（图16）。如表5所示，2.1a亚型毒株SXCDK与2.1b、2.1c和2.1d分别有着93.2-94%、92.5%和92.6%的核苷酸同源性，2.1b亚型毒株与2.1c和2.1d亚型毒株核苷酸有着92.2%-93.1%和92.4-93.3%的同源性，2.1c亚型毒株和2.1d亚型毒株的核苷酸的同源性为91.9-92.0%。此外，序列分析发现，在多聚蛋白中NS5A是所有结构蛋白和非结构蛋白中变异性最大的蛋白，不同2.1亚型之间的氨基酸同源性为92.8-95.4%，这比之前公认的变异性最大的E2（94.4-97.3%）还高（表6）。在2.1b亚型中，GD176,Heb52010,HEBZ和ZJ0801与SXYL2006，GXWZ02相分离，这是该系统进化树的两个分支，而且其核苷酸同源性非常高（表6）。总之，这三株来自我国的2.1亚型流行毒株显示出巨大的遗传多样性，并且NS5A是2.1亚型毒株中最可变的蛋白。此外，GD19是第一个测得全长基因组序列的2.1d亚型分离株。CSFV兔化弱毒株HCLV被认为是针对CSFV最有效果的黄金疫苗，在我国每两年就要接种一次，然而CSF疫情在我国依然严峻，其中95%以上的CSF暴发是由2.1亚型毒株引起的。HCLV和2.1亚型的毒力、免疫源性和复制能力存在一定差异，这可能是他们之间遗传变异的主要原因。因此我们选取包括本实验的三株2.1亚型流行毒株在内的10株在我国流行的2.1亚型毒株同HCLV进行全基因组序列比较，如表6所示，HCLV同2.1亚型毒株核苷酸同源性为84.2-84.9%，氨基酸同源性为91.8-92.2%。我们还比较了疫苗株同2.1亚型毒株不同基因组区域的核苷酸差异性（表7），其中5'UTR同源性最高（92.2-94.1%），其次是NS4A（85.9-90.1％），NS4B（85.5-87.9％），NS3（85.9-86.6％），3'UTRpro（84.4-85.8％）和N（84.1-86.1％）。最可变区分别为P7（79.0-81.9％），E2rns（81.9-83.1％），C（81.5-85.2％），NS5A（82.2-83.5％），E1（82.2-85.8％），E的（82.4-84.4％），NS2（82.6-84.2％）和NS5B（83.5-84.3％）。出乎意料的是HCLV与2.1亚型之间氨基酸序列比较发现NS5A是最可变的蛋白（86.5-87.5％），rns而不是结构蛋白E的（87.7-89.0％），E2（87.9-89.9％），C（87.9-92.9％）和E1（89.2-92.8％）。保守度最高的蛋白是NS3（96.5-97.8％）和NS4A（95.3-98.4％），这与以前的结果一致。与HCLV相比，2.1亚型各毒株上有177个相同的氨基酸位点发生变化，其中NS5A上就有37个氨基酸位点发生变化，取代比率（37/497）51 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析rns和E（18/227）是其中最高的（表8）。此外，发现有19个氨基酸在E2的相同位置发生取代，这可能是疫苗株和流行毒株抗原性发生变化的主要原因。例如在7057617057612.1亚型LPC疫苗株中D和K被N和R取代与抗原特异性有关，其中713729713729HCLVE2中氨基酸残基E和D突变为G和N是抗原特异性的关键。384388384388HCLV的Erns上的B细胞表位DKDAD，而在2.1a上为DRNAD，2.1b384388384388488494上DKNTD，2.1c和2.1d上为DKNAD。其他表位TWFGAYA在rnsE上是保守的。在E2蛋白上用于诊断的单克隆抗体WH303是一个保守表位829837TAVSPTTLR在疫苗株和2.1分离株上完全一致。另外，HCLV的B/C抗原772778777结构域和A抗原结构域相接区域的线性抗原表位残基LFDGTNP上的N，777在2.1亚型分离株中突变成了T。在E2中段N末端氨基酸的突变可能影响HCLV和2.1毒株血清中抗体的结合能力，继而导致免疫逃逸。这表明病毒结构蛋白的糖基化对于病毒生命周期和蛋白质折叠有着重要作用。序列分析结果表明，HCLV的Erns上有8个特定的糖基化位点，2.1分离株367368上另外还多一个糖基化位点（NLT）。HCLV和2.1分离株在E1上有3个相同的糖基化位点。在抗原优势性蛋白E2中，HCLV有7个糖基化位点，但是第777779777777779779一个糖基化位点NPS中N被T取取代，S被A取代。此外，之前报道过B细胞表位（残基777-779）发生N777S的取代会导致E2单克隆抗体反应原性的降低。除了糖蛋白，在非结构蛋白上还发现潜在糖基化序列NXT/S：1571592494249624942496Npro上的一个位点（NFT），NS4B上一个位点（NLS或NLP278727892815281728912893中分离株Heb52010），NS5A上的3个位点（NLS，NNS和NLT），281528172891289331033105以及HCLV上的3个位点（NNS，NLT和NIT）。在GD19上，2815281528152817残基N被替换成D，因此不存在糖基化位点NNS。HCLV株的NS5B319331953211321333163183689369136983700有6个糖基化位点NLT,NKT,NKT3,NTS,NTT379437963193319531933195andNLS，但是在2.1亚型毒株上糖基化位点NLT突变为SLA，因此，在2.1亚型毒株的NS5B上只有5个糖基化位点。然而，在HNLY2011的NS5B蛋白上有一个例外，其第3700氨基酸残基是A，所以HNLY2011的NS5B36983700不存在NTT糖基位点。到目前为止，关于CSFV非结构蛋白糖基化位点以及疫苗株和流行株糖基化位点对病毒的毒力和复制效率影响的信息还很少。3.5小结1.通过7对引物分别对CSFV2.1亚型毒株GD176、GD53和GD19进行了全场基因组序列扩增，并进行了序列测定，其中GD176全基因组长12295nt，GD53全基因组长12296nt，GD19全基因组长12298nt。2.对3株流行毒株进行全基因组序列进行了同源性分析及比对，基于全长基因组系统进化分析表明，GD176于其他5株毒株来自2.1b亚亚型，GD5与之前52 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析报道过的HNLY2011分离株位于2.1c亚亚型，而GD19形成了一个新的独立分支2.1d。表4用于本次分析的来自中国的CSFV分离株Table4RecentCSFVfieldisolatesfromChinaandreferencestrainusedinthisstudyisolateyearofsubgrouptotalsequencelengthoflengthofGenBankisolationlength(nt)5’NTR(nt)3’NTR(nt)accessionno.SXCDK20092.1a12296373226GQ923951GD17620112.1b12296372227thisstudyHeb5201020102.1b12296372227JA268754HEBZ20082.1b12296372227GU592790ZJ080120082.1b12296373226FJ529205SXYL200620062.1b12295372226GQ122383GXWZ0220022.1b12296373226AY367767GD5320112.1c12296372227thisstudyHNLY201120112.1c12296372227JX262391GD1920112.1d12298375226thisstudyHCLV-1.112310373241AF53143353 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析表5CSFV2.1亚型毒株与HCLV株核苷酸序列以及氨基酸序列同源性比较（%）Table5Sequenceidentityofnucleotideandaminoacidsequencesbetweensub-genotype2.1isolatesandHCLVatthegenomiclevels(%)SXCDKGD176Heb52010HEBZZJ0801SXYL2006GXWZ02GD53HNLY2011GD19HCLVSXCDK-93.293.293.293.293.494.092.592.592.684.9GD17696.5-97.096.397.695.195.192.492.492.484.5Heb5201096.598.3-96.397.295.194.892.392.292.484.7HEBZ96.397.797.5-96.395.395.092.592.492.584.6ZJ080196.298.198.097.4-95.195.092.492.492.584.5SXYL200696.597.397.397.196.9-95.392.692.592.784.6GXWZ0296.897.597.397.197.097.2-93.193.193.384.9GD5396.696.696.696.496.396.596.9-98.892.084.2HNLY201196.696.696.596.496.396.596.999.2-91.984.2GD1996.596.696.796.596.496.797.196.696.6-84.7HCLV92.292.192.291.891.891.892.091.991.992.1-54 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析表6CSFV2.1亚型中各亚亚型之间核苷酸及氨基酸同源性比较（%）Table6Sequenceidentityofnucleotideandaminoacidsequencesbetweendifferentgroupsofsub-genotype2.1fieldisolates(%)E22.1a2.1b2.1c2.1dNS5A2.1a2.1b2.1c2.1d2.1a-91.6-93.490.491.92.1a-91.1-92.691.2-91.390.52.1b94.4-96.2-90.5-92.491.7-93.42.1b93.8-95.4-90.0-92.490.5-91.72.1c96.0-96.298.3-90.9-91.12.1c93.0-93.692.8-94.8-91.5-91.62.1d95.494.6-97.196.0-97.8-2.1d93.293.8-94.493.0-93.6-55 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析表7CSFV流行毒株与HCLV之间不同区域间核苷酸及氨基酸同源性比较（%）Table7SequenceidentityofnucleotideandaminoacidsequencesofindividualregionsbetweenCSFVfieldisolatesandHCLV(%)prornsNCoreEE1E2P7NS2NS3NS4ANS4BNS5ANS5B5’NTR/3’NTRHCLV-------------SXCDK84.7(94.0)83.5(89.9)82.8(88.5)85.3(92.8)83.1(89.8)81.0(90.0)84.2(89.3)86.6(97.8)87.5(96.9)87.9(94.5)82.2(87.5)84.2(92.9)93.5/85.3GD17686.1(93.5)84.8(92.9)83.1(88.1)84.8(90.8)82.5(88.7)81.0(90.0)83.5(90.2)85.8(97.5)88.5(98.4)86.5(94.5)82.6(87.1)84.0(92.9)92.2/84.5Heb5201085.9(94.0)85.2(91.9)83.8(88.1)84.8(91.3)82.5(88.5)79.0(90.0)83.3(90.2)86.2(97.2)87.0(98.4)85.9(94.5)83.5(87.5)84.3(93.6)92.2/84.5HEBZ85.5(93.5)83.8(90.9)83.0(87.7)84.4(89.2)82.1(88.5)81.0(88.6)83.5(91.0)86.3(96.8)87.5(96.9)86.5(94.5)83.4(87.3)84.3(92.9)92.7/84.5ZJ080186.1(93.5)84.5(91.9)83.7(88.1)84.4(91.3)82.1(87.9)80.0(88.6)82.6(89.5)85.9(96.5)87.5(98.4)86.9(95.4)83.4(87.3)84.0(92.9)92.7/84.4GXWZ0285.5(93.4)83.8(88.9)82.4(87.7)84.1(90.3)82.0(88.5)80.5(88.6)84.1(90.6)85.9(97.7)88.0(98.4)87.2(95.4)83.0(86.5)84.0(92.3)93.0/85.3SXYL200686.1(94.6)84.8(90.9)83.8(88.5)85.8(91.8)83.1(88.7)80.0(91.4)83.4(89.9)86.6(97.1)90.1(98.4)86.4(94.8)83.2(87.3)83.8(92.5)93.3/85.3GD5384.5(91.1)81.8(87.9)83.1(89.0)82.2(90.3)81.9(88.7)81.9(90.0)83.7(90.2)86.5(97.4)86.5(95.3)85.6(95.4)82.7(87.1)83.5(93.3)92.7/85.8HNLY201184.1(91.1)81.5(87.9)83.6(88.5)82.4(90.8)82.2(89.5)81.9(90.0)83.4(90.6)86.1(97.1)85.9(95.3)85.5(94.8)82.8(86.5)83.5(93.2)93.8/85.8GD1985.5(92.9)84.8(91.9)84.4(89.0)82.9(90.8)82.7(88.7)80.0(90.0)83.1(89.9)85.7(97.8)88.5(98.4)87.2(93.9)83.1(87.1)84.2(93.2)94.1/85.856 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析表8CSFV2.1亚型毒株与HCLV氨基酸差异位点比较Table8ConsensusaminoacidchangesbetweenHCLVandCSFV2.1fieldisolatesviralproteinno.ofchangesaminoacidsubstitutionproN(168)4K57R,V109A,T151S,I155TCore(99)4E178D,I184M,R201K,R203KrnsE(227)18N281S,H285Q,G302E,V316T,G330R,K337R,H352Y,D367N,A369T,S420G,T431I,L442F,A445T,N459K,A468T,R481K,G484R,R485GE1(195)11S503R,V558I,V577A,P581S,D583E,E598G,V612I,E628K,V636A,I660T,V679IE2(373)19D705N,L709P,G713E,D725G,N729D,K734R,K761R,R798G,S799F,D847E,N863K,L889Q,D901K,G902E,K979R,R994K,R1032H,S1034T,V1053IP7(70)6P1064Q,I1082N,V1094I,I1095M,I1119M,V1126INS2(457)24L1142Q,G1144E,S1146N,T1154A,A1159V,P1179T,M1185I,L1189F,I1193L,T1244A,F1255Y,R1316K,A1319T,F1329Y,M1357I,G1359S,V1373I,I1444V,V1463I,E1494D,F1529I,E1535D,V1538L,R1549KNS3(683)14M1607I,T1792A,S1806N,F1906Y,V1943A,D1962E,K1967E,S1888N,T2003A,D2169E,M2173V,K2207R,S2214T,T2226ANS4A(64)1I2306VNS4B(347)13M2348V,K2367R,T2380A,M2387I,A2391I,I2398L,T2405V,S2414G,G2419H,D2469E,A2479V,T2511K,V2679INS5A(497)37M2706I,Q2730H,F2733Y,V2736M,K2739R,K2745R,N2751T,E2762G,L2789S,I2820V,H2846Q,L2875I,K2907R,A2943V,L2940P,M2942K,I2946V,S2982L,G2984D,L2986S,G2997D,T3004P,A3018V,V3045I,Y3046F,G3048S,V3054L,D3056E,V3066I,R3070K,N3073T,A3090T,R3098K,N3113D,P3115L,H3140R,R3142KNS5B(718)26N3193S,A3214T,T3230V,S3231G,S3240P,S3272G,R3275K,D3278E,I3280V,Y3286H,S3320G,P3342T,S3382A,N3427S,K3536R,Y3547F,T3462M,I3682V,K3754R,V3799T,A3802V,R3852K,N3865S,Q3868E,M3881V,T3892A57 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析ABCDEF图16我国CSFV2.1亚型系统进化树Fig.16PhylogenyofrecentCSFVsub-genotype2.1fieldisolatesfromChina.图16使用Mega6.06对我国CSFV2.1亚型毒株进行系统进化分析，分别根据全基因组（A）、5’-UTR（B）、Erns（C）、E2（D）、NS5A（E）和NS5B（F）构建，进化树分析选择使用邻接法，bootstrap设为1000个重复-58 吉林农业大学硕士学位论文第三章CSFV2.1亚型毒株全基因组序列测定及分析图17CSFV2.1亚型NS5A氨基酸序列比对结果Fig.17MultiplesequencealignmentofdeducedaminoacidsequencesofNS5A.图17.使用DNAStar软件包中的MEGALIGN，采用ClustalW比对法对2.1亚型毒株的NS5A进行比对分析，HCLV株作为参考。59 吉林农业大学硕士学位论文结论结论1.对采集自广东省的3株CSFV2.1亚型流行毒株进行了检测和体外细胞分离培养，成功获得了高度适应PK-15细胞的2.1亚亚型毒株GD176、GD53和GD19分离株.2.对细胞适应毒的生长动力学进行了鉴定，这些病毒株有望成为CSFV感染和致病特性研究的标准毒株。3.对CSFV2.1b亚型毒株GD176、2.1c亚型毒株GD53和2.1d亚型毒株GD19进行了全基因组测序分析，GD53全基因组为12296nt，GD176为12295nt，GD19为12298nt。4.并首次分离获得2.1d亚型毒株GD19，并对其全基因组序列进行测定。60 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吉林农业大学硕士学位论文附1GD53‐F2GD53‐F4GD53‐F6GD53‐F7GD53‐F9GD53‐F10GD53‐F11GD53‐F112GD53‐F14GD53‐F16GD53‐F17GD53‐F18GD53‐F20GD53‐F22GD53‐F2470附2：CSFVGD53不同代次IFA荧光鉴定结果 吉林农业大学硕士学位论文附171 吉林农业大学硕士学位论文附1GD53‐F26GD53‐F28GD53‐F30GD53‐F32GD53‐F33GD53‐F35GD53‐F37GD53‐F39GD53‐F41GD53‐F44GD53‐F45GD53‐F4672 吉林农业大学硕士学位论文附1附3：CSFVGD19不同代次IFA荧光鉴定结果73 吉林农业大学硕士学位论文附1GD19‐F2GD19‐F4GD19‐F6GD19‐F8GD19‐F10GD19‐F14GD19‐F16GD19‐F18GD19‐F19GD19‐F22GD19‐F24GD19‐F2674 吉林农业大学硕士学位论文附1GD19‐F32GD19‐F33GD19‐F34GD19‐F35GD19‐F36GD19‐F37GD19‐F38GD19‐F40GD19‐F41GD19‐F43GD19‐F44GD19‐F4675 吉林农业大学硕士学位论文附1GD19‐F28GD19‐F29GD19‐F3076 吉林农业大学硕士学位论文附1附4：GD176全基因组序列GTATACGAGGTTAGTTCGTTCTCGTGTACAATATTGGACAAACAAAATTCCGATTTGGCTTAGGACACCCCTCCAGCGACGGCCGAACTGGGCTAGCCATGCCCACAGTAGGACTAGCAGATGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGGAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACTCACCTTAACCCTGGCGGGGGTCGCCAGGGTGAAATCACATCATGTGATGGGGGTACGACCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTAACAGGCTAGTATAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGAATCATTTTGAACTATTATACAAAACAAACAAACAAAAACCAATGGGAGTGGAGGAACCGGTGTATGACACCGCAGGGAGACCATTATTTGGGGACCCAAGTGAGGTACACCCACAATCAACATTGAAGCTACCACACGACAGGGGGAGAGGTAACATCAGAACTACACTGAAGGACCTACCTAGGAAAGGCGACTGTAGGAGTGGAAACCACCTAGGACCAGTTAGTGGGATATACATAAAGCCTGGCCCTGTCTTCTATCAGGACTACATGGGCCCTGTCTACCATAGAGCCCCATTAGAGTTTTTTGGTGAGGCCCAATTTTGTGAGGTGACCAAGAGAATAGGTAGGGTGACGGGTAGTGACGGAAAGCTCTACCATATATATGTGTGCATCGACGGTTGCATACTGTTGAAGTTAGCCAAGAGGGGTGCGCCCAGATCCCTAAAGTGGACTAGGAACTTTACCGACTGCCCACTGTGGGTCACTAGTTGTTCTGATGATGGCGCAGATGGCAGCAAGGATAAGAAACCAGACAGGATGAACAAGGGTAAATTAAAGATAGCCCCAAAAGAGCATGAAAAGGACAGCAAGACCAAGCCACCTGATGCTACGATTGTGGTAGAGGGAGTAAAATATCAAGTAAAAAAGAAAGGCAAAGTCAAAGGGAAGAATACTCAAGATGGCCTATACCATAATAAGAACAAACCACCAGAGTCCAGGAAGAAACTAGAAAAAGCCCTATTGGCTTGGGCAGTGATAGCAGTCATGCTGTACCAGCCCGTAGTAGCCGAGAATATAACTCAATGGAACCTGAGTGACAACGGCACAAGCGGCATCCAGCAAGTTATGTATCTCAGAGGGGTCAATAGGAGCTTACATGGGATCTGGCCTGAAAAAATATGCAAGGGGGTCCCTACTCATCTGGCCACTGACACGGAACTGATAGAGATACGTGGGATGATGGACGCCAGTGAGAGGACGAACTACACGTGTTGTAGGTTGCAGAGACACGAATGGAATAAACATGGATGGTGTAACTGGTACAACATAGACCCTTGGATCCAGTTAATGAACAGGACCCAAGCAAATCTGACAGAAGGCCCTCCGGATAAAGAGTGCGCCGTGACTTGCAGGTATGACAAAAATACCGACGTTAACGTGGTCACCCAGGCCAGGAATAGACCAACTACTCTGACTGGCTGCAAGAAAGGAAAAAATTTCTCATTTGCAGGTACGGTCATAGAGGGCCCATGCAATTTCAACGTATCCGTGGAGGACATCTTATATGGAGATCATGAGTGTGGCAGCCTGTTCCAGGACACGGCTCTATACCTATTAGATGGAATGACTAACACAATAGAGAAAGCCAGGCAGGGTGCGGCAAGGGCCACATCTTGGCTAGGGAGGCAACTCAGAACCACAGGGAAGAAGCTGGAGAGAGGAAGCAAAACCTGGTTCGGTGCCTATGCCCTGTCACCTTACTGCAATGTAACAAGGAAAATAGGGTACATATGGTACACGAACAATTGCACTCCGGCATGCCTCCCAACAAACACAAAAATAATAGGCCCAGGAAAATTTGACACCAACGCAGAAGACGGGAGGATTCTTCATGAAATGGGGGGCCACCTATCAGAATTCTTGTTGCTTTCTCTGGTAATCCTGTCTGACTTCGCCCCAGAAACGGCCAGTACATTATACCTAATCTTACACTATGCAATCCCGCAGTCCCATGAAGAACCTGAGGGTTGCGACACGAATCAGCTCAACCTAACAGTGGGACTTAGGACAGAAGATGTGGTACCATCATCAGTCTGGAACATTGGTAAATATGTGTGTGTTAGACCAGATTGGTGGCCGTATGAAACTAAGGTGGCCCTACTGTTTGAAGAGGCAGGACAGGTTGTAAAGTTAGCTCTACGGGCACTGAGGGATTTAACTAGAGTCTGGAACAGTGCATCAACTACTGCATTCCTCATCTGCTTGATAAAAATATTAAGAGGGCAGGTTGTGCAAGGTATAATATGGCTGCTGCTAGTGACCGGGGCACAAGGGCGGCTGTCCTGTAAGGAAGACTACAGGTATGCGATATCATCAACCAATGAGATAGGGCCGCTAGGGGCTGAAGGTCTCACCACCACTTGGAGAGAGTATAGGCATGGTTTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATTTGCACTGCAGGGTCCTTTAAAGTTATAGCACTTAATGTGGTTAGCAGGAGGTACCTGGCATCATTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTAACATTTGAACTCCTATTTGATGGGACTAGTCCAGCGATTGAGGAGATGGGAGATGACTTTGGATTTGGGCTGTGCCCTTTTGACACAACCCCAGTGGTAAAAGGGAAGTACAATACCACTCTATTAAACGGTAGTGCTTTCTACCTAGTCTGCCCAATAGGATGGACGGGTGTCATAGAGTGC77 吉林农业大学硕士学位论文附1ACAGCAGTAAGCCCTACAACCTTGAGAACAGAAGTGGTGAAGACCTTCAAGAGAGAGAAGCCTTTCCCACACAGAGTGGATTGCGTGACCACTATAGTAGAGAAAGAAGACCTGTTCTACTGCAAGTGGGGGGGTAATTGGACATGTGTGAAAGGCAACCCGGTGACCTACATGGGGGGGCAAGTAAAACAATGCAAGTGGTGTGGTTTTGACTTCAAGGAGCCCGATGGGCTCCCACACTACCCCATAGGCAAGTGCGTCCTAGCAAATGAGACGGGTTACAGGGTAGTGGATTCCACAGACTGCAATAGAGATGGCGTTGTTATCAGCACTGAAGGGGAACACGAGTGCTTGATTGGCAACACCACCGTCAAGGTGCACGCGTTGGATGGAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCCAAAGAAATCGTCTCCAGTGCGGGACCTGTAAGGAAAACTTCCTGTACTTTCAATTACACAAAGACACTAAAAAACAAGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTATTTTCAGCAATATATGCTTAAGGGCGAGTACCAATACTGGTTTGACCTGGACGCGACTGACCACCACACAGACTACTTCGCCGAATTTGTTGTCTTGGTGGTAGTGGCACTATTGGGTGGGAGGTACGTCCTGTGGCTAATAGTGACCTATATAGTTCTAACAGAGCAACTTGCTGCCGGTTTACAGCTGGGCCAAGGCGAGGTGGTACTGATAGGGAACTTAATTACCCACACGGACAATGAGGTAGTGGTGTACTTCTTAATGCTCTACCTAATAATAAGGGATGAGCCCATAAAGAAATGGATACTACTGCTGTTTCATGCCATGACCAACAACCCAGTTAAGACTATGACAGTAGCATTGCTGATGATCAGTGGGGTCGCCAAGGGTAGGATAACAGATGGTGGTTGGCAGAGACAGCCGGAGACCAATTTTGACATCCAACTCGCACTGGCAGTAATAGTAGTCGTTGTGATGTTATTGGCAAAGAGAGATCCGACTACTCTCCCCCTGGTGATCACAGTGGCAACCTTAAGAACAGTTAAGATAACCAATGGTTTCAGCACAGATCTAGCTATAGCCACGGTGTCGGCAGCTTTGCTAACCTGGACTTATATCAGTGACTACTACAAATACAAGACTTGGCTACAGTACCTCATCAGCACGGTGACTGGAATCTTCCTGATAAGGGTACTGAAGGGAGTAGGCGAGTTAGACCTGCACGCCCCAGCTCTGCCGTCTCACAGACCCCTTTTTTACATCCTCGTGTATCTCATCTCCACTGCTGTGGTGACTAGATGGAACCTGGACGTAGCCGGACTGCTGCTACAGTGTGTCCCAACACTTCTAATGGTGTTCACGATGTGGGCTGACATTCTCACCCTAATTCTCATATTACCCACTTATGAACTGGCAAAGTTATACTATCTTAAGGAAGTGAAGATTGGAACCGAAAGAGGATGGCTATGGAAAACTAACTATAAGAGGGTAAATGACATCTATGAAGTCGACCAAGCTGGTGAGGGGGTCTACCTCTTCCCTTCGAAACAAAAGACTAGTGCTATAACGAGCACCATGTTGCCGTTGATCAAAGCCATACTCATTAGCTGCATCAGTAACAAGTGGCAATTCATATATTTGCTGTACTTGATATTTGAAGTGTCCTACTACCTCCACAGAAAAGTCATAGATGAAATAGCTGGCGGGACCAACTTCGTTTCAAGACTAGTGGCAGCCTTAATTGAAGTTAATTGGGCCTTCGACAATGAAGAAGTTAGAGGCCTAAAGAAGTTCTTCTTGCTGTCTAGTAGAGTTAAAGAGTTGGTCATCAAACACAAGGTGAGGAATGAAGTAGTGGCCCGCTGGTTTGGAGATGAGGAGATCTACGGGATGCCAAAGTTGATCGGCTTAGTTAAGGCAGCAACTCTAAGTAAAAACAAACACTGTATCTTGTGCACCGTCTGTGAGGACAGAGACTGGAGAGGAGAAACTTGCCCGAAATGCGGGCGTTTCGGACCACCAGTGATCTGTGGTATGACCCTAGCTGACTTCGAGGAGAAGCACTATAAGAGGATATTCATCAGGGAGGACCAATCAGATGGGCCACTCAGGGAGGAGCATGCAGGGTACTTACAGTACAAAGCTAGGGGTCAATTGTTTCTAAGGAATCTCCCAGTGTTGGCGACAAAAGTCAAGATGCTCCTGGTTGGTAACCTCGGGACGGAGGTTGGGGATTTGGAGCACCTTGGCTGGGTGCTTAGAGGGCCCGCTGTCTGCAAGAAGGTTACTGAACATGAAAAGTGTGCCACGTCTATAATGGATAAGTTGACTGCTTTCTTCGGTGTTATGCCGAGAGGTACCACCCCCAGAGCTCCCGTAAGGTTTCCCACCTCCCTCCTGAAGATAAGAAGAGGGCTGGAGACGGGCTGGGCTTACACACACCAAGGCGGCATCAGCTCAGTTGACCATGTCACTTGTGGGAAAGACTTGCTGGTATGCGACACCATGGGTCGGACAAGGGTCGTCTGCCAATCAAACAACAAGATGACTGACGAGTCCGAATACGGGGTCAAAACCGACTCAGGGTGCCCAGAGGGAGCCAGATGTTATGTGTTCAACCCTGAGGCAGTCAACATATCAGGCACTAAAGGGGCCATGGTCCACTTACAGAAAACTGGCGGAGAATTCACTTGCGTAACAGCATCCGGAACCCCGGCTTTCTTTGACCTCAAGAACCTCAAGGGCTGGTCAGGGCTACCGATATTTGAGGCATCGAGTGGAAGGGTAGTCGGAAGGGTCAAGGTTGGGAAGAACGAAGACTCTAAACCAACCAAACTCATGAGTGGGATACAGACAGTCTCTAAAAGTGCCACTGACTTGACGGAGATGGTAAAGAAAATAACAATTATGAACAGGGGAGAGTTCAGACAGATAACCTTGGCCACAGGTGCTGGAAAAACTACAGAGCTCCCCAGGTCAGTCATAGAAGAGATAGGGAGACACAAAAGGGTGTTGGTATTGATCCCCTTGAGGGCCGCAGCAGAATCAGTATACCAATATATGAGGCAGAAACACCCGAGTATAGCATTCAACCTGAGGATAGGGGAGATGAAGGAAGGTGAC78 吉林农业大学硕士学位论文附1ATGGCCACGGGGATAACCTATGCCTCTTACGGTTACTTCTGCCAGATGCCACAACCTAAGCTGAGGGCCGCAATGGTAGAGTATTCCTACATCTTTCTAGATGAGTACCATTGCGCCACCCCAGAACAACTGGCTATCATGGGGAAGATCCACAGATTCTCAGAGAACCTGCGGGTGGTAGCTATGACAGCGACACCAGCAGGCACAGTAACAACTACTGGGCAGAAACACCCTATAGAGGAGTTCATAGCCCCGGAAGTAATGAAAGGAGAAGACTTAGGTTCGGAGTACTTAGACATAGCCGGACTAAAGATACCAGTAGAGGAGATGAAGAACAATATGCTAGTTTTTGTACCAACTAGGAACATGGCGGTAGAGGCGGCAAAGAAATTGAAAGCTAAAGGATATAACTCAGGCTATTACTACAGTGGTGAGGACCCATCTAACCTGAGGGTAGTCACATCGCAGTCCCCATACGTGGTTGTAGCGACCAACGCAATAGAATCAGGCGTCACTCTCCCGGACCTGGACGTGGTCGTTGACACGGGACTCAAGTGCGAAAAAAGAATCCGATTGTCACCCAGGATGCCTTTCATAGTGACTGGCCTAAAAAGAATGGCTGTCACCATCGGGGAACAAGCCCAGAGAAGAGGGAGGGTTGGAAGAGTGAAGCCCGGGAGATACTACAGGAGCCAAGAAACCCCTGTCGGCTCTAAGGACTACCATTATGATCTATTGCAAGCCCAGAGGTACGGCATAGAAGATGGGATAAATATCACCAAATCCTTCAGAGAGATGAACTATGATTGGAGCCTCTATGAGGAAGATAGCCTGATGATAACACAGCTGGAGATCCTCAACAATCTGTTGATATCAGAGGAGCTGCCGGTGGCAGTAAAAAATATAATGGCTAGGACTGACCACCCAGAACCAATCCAACTAGCATATAACAGCTATGAGACACAGGTGCCTGTGTTGTTCCCAAAGATAAGAAATGGGGAGGTCACTGACACTTACGATAATTACACCTTCCTCAATGCAAGAAAATTGGGAGATGATGTACCACCCTACGTGTATGCCACAGAAGATGAGGACTTGGCAGTGGAATTGCTGGGCCTAGATTGGCCAGACCCTGGGAACCAAGGCACTGTGGAGGCTGGCAGGGCACTAAAACAGGTGGTTGGCCTATCAACAGCCGAGAATGCCCTGTTAGTAGCCTTGTTTGGTTACGTAGGGTACCAGGCCCTCTCAAAGAGGCATATACCTGTGGTCACAGACATATACTCAGTCGAAGATCACAGGCTAGAGGACACCACACACCTACAGTACGCTCCAAATGCCATTAAGACGGAGGGGAAGGAGACTGAATTGAAAGAGTTGGCCCAAGGGGATGTGCAGAAGTGCGTGGAAGCAGTGACCAACTACGCGAGAGAGGGCATCCAATTTATGAAGTCACAGGCACTAAAGGTGAGAGAAACCCCTACTTATAAGGATACAATGAATACTGTAGCTGACTATGTGGAAAAGTTTATCGAGGCACTGTCGGATAGCAAGGAAGACATCTTGAAATATGGGCTGTGGGGTGTGCATACGGCCTTGTACAAGAGCATTGGTGCCAGGCTTGGTCACGAAACCGCGTTCGCAACTCTAGTCGTGAAATGGTTGGCATTTGGGGGGGAATCAATAGCAGATCATATAAAACAAGCAGCTACAGACTTGGTTGTCTACTATATCATCAATAGACCTCAGTTCCCAGGAGACACGGAGACGCAACAAGAGGGGAGAAAATTTGTGGCCAGCCTATTGGTCTCAGCCCTAGCAACTTACACATATAAAGGCTGGAACTATAATAACCTGTCCAAGATAGTTGAACCGGCTTTGGCTACCCTGCCCTATGCCGCTAAAGCCCTTAAATTATTTGCCCCCACCAGACTGGAGAGCGTCGTCATATTGAGCACTGCAATCTACAAAACATATCTATCAATCAGGCGAGGCAAAAGCGACGGGTTGCTAGGTACAGGGGTTAGTGCGGCTATGGAGATTATGTCACAAAACCCGGTATCAGTGGGCATAGCAGTTATGCTAGGGGTCGGGGCTGTAGCAGCACACAACGCAATCGAAGCCAGTGAGCAGAAGAGAACGCTACTTATGAAAGTCTTTGTAAAAAACTTCTTGGACCAAGCAGCCACAGATGAACTAGTCAAAGAGAGCCCTGAGAAAATAATAATGGCCCTGTTTGAAGCAGTGCAAACAGTAGGCAATCCTCTTAGGCTAGTGTACCACCTATACGGAGTTTTTTATAAAGGGTGGGAAGCAAAAGAGTTGGCCCAAAGGACAGCCGGCAGGAATCTTTTCACCTTGATAATGTTTGAGGCCGTGGAACTACTGGGAGTAGATAGCGAAGGAAAAATCCGCCAGCTATCGAGTAATTACATATTAGAGCTCCTGTATAAGTTCCGTGACAGTATTAAGTCTAGTGTGAGGGAGATAGCAATCAGCTGGGCCCCTGCCCCCTTTAGTTGCGACTGGACACCAACAGATGACAGAATAGGGCTTCCCCATAACAATTACCTCCAAATGGAGACAAGATGCCCTTGTGGCTACAGGATGAAAGCAGTAAAAACCTGCGCTGGGGAGTTGAGACTTCTGGAAGAAGGAGGTTCATTCCTCTGCAGGAATAAATTCGGTAGAGGGTCGCAGAACTATAGGGTGACAAAATACTATGATGACAATTTATCAGAGATAAAACCAGTGATAAGGATGGAAGGACACGTGGAACTGTATTATAAGGGGGCCACCATCAAACTGGACTTTAACAACAGTAAAACAGTACTGGCAACCGACAAATGGGAGGTCGACCATTCTACCCTGGTAAGGGCGCTTAAGAGGTACACAGGGGCTGGATACCAAGGGGCGTATCTGGGTGAGAAACCTAACCACAGACATCTGATAGAGAGAGACTGTGCAACGATCACAAAAGACAAGGTCTACTTCATCAAGATGAAGAGGGGGTGTGCGTTCACTTATGACTTATCCCTCCACAACCTCACCCGGCTAATCGAATTGGTACACAAGAACAACCTGGAAGATAGAGAAATCCCCGCCATTACGGTTACAACCTGGCTGGCCTACACATTTGTGAA79 吉林农业大学硕士学位论文附1CGAAGACATAGGGACTATAAAACCAGTTTTTGGGGAAAAAGTAACACCAGAAAAGCAGGAGGAGGTAGCCTTGCAACCTGCTGTGGTGGTGGACACAACAGATGCGACCGTAACCGTGATGGGGGAAACCTCTATTATGACTACAGGGGAGACCCCGACGACATTTACCAGCTTAGGTTCAGACTCTAAGGTTCAACAAGTCCTGAAGTTGGGGGTGGACGAGGGTCAATACCCCGGGCCCAGTCAGCAGAGAGCAAGCTTGCTCGAGGCTATACAAGGTGTGGATGAAAGGCCTTCAGTACTGATATTGGGGTCTGATAAAGCTACCTCCAACAGGGTAAAGACCGCAAAGAATGTCAAGATATTCAGGAGCAGAGACCCCCTGGAACTGAGGGAAATGATGAGAAGAGGGAAGATCCTGGTCATAGCCCTATGTAAGGTCGACACCACTCTACTGAAATTTGTCGATTACAAAGGTACCTTCTTAACCAGAGAAACCCTAGAGGCATTAAGTCTGGGCAAGCCTAAGAAAAGAGACATAACCAAGACAGAAGCACAATGGTTGTTGTGCCTCGAAGACCAAATAGAAGAGCTGCCTGACTGGTTCGCAGCCAAGGAGCCCATATTTCTAGAAGCCAGCATCAAACGTGACAAGTACCACCTGGTGGGGGACATAGCTACTATCAAAGAAAAAGCTAAACAACTGGGGGCAACAGACTCCACAAAGATATCAAAAGAGGTTGGCGCTAAAGTATATTCTATGAAACTGAGTAACTGGGTGATACAAGAAGAGAATAAACATGGCAGCTTAGCCCCCTTGTTTGAAGAGCTCCTGCAACAGTGCCCACCTGGGGGCCAGAATAAAACCACACATATGGTCTCAGCCTACCAACTGGCTCAAGGGAACTGGATGCCGGTTGGTTGCCACGTGTTTATGGGGACCATACCTGCCAGAAGAACCAAGACCCATCCCTATGAGGCATATGTCAAGTTGAGGGAGTTGGTAGATGAATATAAGATGAAGACATTATGCAGCGGTTCAGGCCTAAGCAAGCACAACGAATGGGTAATTCGCAAGATCAGGCATCAAGGGAATCTGAGGACCAAACACATGTTGAACCCCGGAAAGGTTGCAGAGCAACTGCATAGAGAAGGGCACAGACACAATGTATATAATAAGACTATAGGTTCAGTGATGACAGCAACTGGCATCAGGCTGGAAAAATTACCCGTGGTTAGGGCCCAAACAGATACAACCAACTTCCATCAAGCAATAAGGGATAAAATAGACAAGGAAGAGAACCTACAGACCCCAGGCTTGCACAAGAAGTTAATGGAAGTCTTCAATGCATTAAAAAGACCTGATCTTGAGGCCTCTTACGACGCTGTGGAGTGGGAGGAATTAGAGAAAGGAATAAATAGGAAGGGTGCAGCTGGTTTCTTTGAACGCAAGAATATAGGAGAGGTTCTGGATTCAGAAAAAAATAAGGTTGAAGAGATCATAGACAGTTTGAGAAAAGGTAGGAGTATCAAGTATTATGAAACTGCAATCCCAAAAAACGAGAAGAGGGACGTTAATGATGACTGGACTGCCGGTGACTTTGTGGACGAGAAAAGGCCCAGGGTGATACAATACCCTGAGGCTAAAACCAGGTTGGCCATCACTAAAGTAATGTACAAGTGGGTGAAGCAGAAACCAGTAGTTATACCCGGCTATGAAGGTAAAACACCTCTGTTCCAAATTTTTGATAAAGTGAAGAAAGAATGGGACCAATTCCAAAATCCAGTGGCTGTGAGCTTTGACACTAAAGCGTGGGATACCCAGGTGACCACAAGAGACCTGGAACTGATAAGGGATATACAGAAGTTCTACTTCAAGAAGAAGTGGCACAAATTCATTGACACCTTAACTATGCACATGTCAGAAGTACCCGTAATTAGTGCCGACGGGGAGGTGTACATAAGGAAGGGGCAGAGAGGCAGTGGACAACCTGATACGAGCGCAGGCAACAGTATGTTGAATGTGTTAACAATGGTTTATGCCTTCTGTGAGGCCACGGGAGTGCCCTATAAGAGCTTCGACAGAGTGGCAAAGATCCACGTCTGCGGGGATGATGGTTTCTTGATCACTGAAAGGGCTCTTGGTGAAAAATTTTCGAGTAAAGGAGTCCAGATCCTATATGAAGCTGGTAAGCCCCaAAAAATTACAGAAGGGGATAAGATGAAAGTGGCCTATCAGTTTGACGACATCGAGTTCTGCTCCCATACGCCAGTGCAGGTAAGATGGTCAGACAATACTTCTAGTTATATGCCTGGGAGGAATACGACTACAATCCTGGCAAAAATGGCTACAAGGTTAGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTACTATAGCATATGAGAAGGCAGTGGCGTTCAGCTTCTTATTGATGTACTCCTGGAACCCACTGGTCAGAAGGATATGCTTATTGGTGTTGTCAACTGAACTGCAAGTGAGACCAGGGAAGTCAACCACTTATTATTATGAAGGGGACCCAATATCTGCTTATAAGGAGGTCATAGGCCATAATCTCTTTGACCTTAAAAGAACAAGTTTTGAGAAACTAGCTAAGTTAAATCTTAGTATGTCCACACTCGGGGTATGGACCAGACACACCAGCAAAAGATTACTACAAGACTGTGTCAACGTCGGCTCTAAAGAGGGTAACTGGCTAGTTAACGCAGACAGACTGGTGAGCAGCAAGACAGGAAATAGGTATATACCTGGAGAGGGTCATACCCAGCAAGGGAAACATTATGAAGAGCTGATATTGGCAAGGAAGCCGATCAGCAATTTTGAAGGGATTGATAGATATAATCTGGGCCCAATAGTCAACGTAGTGTTGAGGAGGCTGAGAGTCATGATGATGGCCCTTATAGGGAGGGGGGTGTAAGAATGGCCGGCCCTTAACTGGGCCCTATCAGTAGAACCCTGTTGTAAATAACATTAACTTATTATTTATTTAAATACTATTATTTATTTATTTATTTATTTATTGAATGAGCAAGGATTGGTACAAACTACCTCATGTTACCACACTACACTCATTTTAACAGCACTTTAGCTGGAGGGAAAATCCTGACGTCCATAGTTGGACTAAGGTAATTTCCTA80 吉林农业大学硕士学位论文附1ACGGCCC81 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附2附5：GD53全基因组序列GTATACGAGGTTAGTTCGTTCTCGTGTACAAAATTGGACAAATTAAATTCTGATTCGACCTAGGGCATCCCTCCAGCGACGGCCAACCTGGGCTAGCCATGCCCACAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGGAGCCCACCTTGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTGGCGGGGGTCGCTAGGGTGAAATCACACCATGTGATGGGGGTACGACCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTAACAGGCTAGTATAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGAATCATTTTGAACTATTATACAAAACAAACAAACAAAAACCAATGGGAGTGGAGGAACCGGTGTATGACATCGCAGGAAGACCACTATTCGGGGACCCAAGTGAGGTGCACCCACAATCAACGCTGAAGCTGCCACATGACAGGGGGAGAGGTAATGTCAGAACAACACTGAAAAACCTACCTAGGAAAGGCGACTGCAGGAGTGGAAACCATCTAGGACCAGTCAGTGGGATATACATAAAGCCCGGCCCTGTCTTCTTTCAGGATTACGTGGGCCCCGTCTACCATAGAGCCCCACTAGAGTTCTTTGAAGAGGCCCAATTCTGTGATGTGACCAAGAGAATAGGTAGGGTGACGGGTAGTGATGGAAAGCTCTACCACATATACGTGTGCATCGACGGTTGCATATTGTTGAAGTTAGCCAAAAGGGGCACGCCCAGATCCCTGAAATGGACTAGGAACTTCACCGACTGTCCACTGTGGGTCACTAGTTGTTCTGATGATGGTGCAGGTGGTGGCAAGGACAAGAAACCAGACAGGATGAACAAGGGTAAATTAAAGATAGCCCCTAAAGAGCATGAGAAGGACAGCAAAACCAAGCCACCTGATGCCACGATCGTGGTAGAGGGAGTGAAATACCAAGTAAAAAAGAAAGGCAAGGTCAAAGGGAAGAGCACTCAAGATGGTCTGTACCATAATAAGAACAAACCACCAGAGTCCAGGAAGAAATTAGAAAAAGCCCTATTGGCTTGGGCAATAATAACAATTGTGATGTATCAGCCTGTAGCGGCTGAGAATATAACTCAATGGAACCTGAGTGACAATGGCACAAGCGGCATCCAGCAAGCCATGTATCTTAGAGGGGTCAATAGAAGCTTACACGGAATCTGGCCTGAAAAAATATGTAAAGGGGTCCCTTCTCATCTGGCCACTGATACGGAACTAACAGAGATACGTGGGATGATGGACGCCAGCGAGAGGACAAACTATACATGTTGTAGGCTGCAGAGACACGAATGGAATAAACATGGATGGTGCAACTGGTACAACATAGACCCTTGGATTCAGTTAATGAACAGGACCCAAGCAAATTTGACAGAAGGCCCTCCAGATAAAGAGTGCGCCGTGACCTGCAGATATGACAAAAATGCCGACGTTAACGTGGTCACCCAGGCCAGGAATAGACCAACCACTCTGACTGGCTGCAAGAAAGGGAAAAATTTTTCATTTGCAGGTACGGTTATAGAGGGTCCATGCAATTTCAATGTATCTGTGGAGGACATCTTATATGGAGACCATGAGTGTGGCAGTCTGTTCCAGGACACGGCTCTGTACCTATTAGATGGAATGACCAACACTATAGAGAAAGCCAGGCAGGGTGCGGCGAGAGTTACGTCTTGGCTTGGGAGGCAACTCAGGACCACAGGGAAGAAGTTGGAGAGAGGAAGCAAAACCTGGTTCGGTGCCTATGCCCTGTCACCTTATTGCAATGTGACAAGGAAGATAGGGTACATATGGTACACGAACAATTGCACTCCGGCATGCCTCCCAAAAAACACAAAAATAATAGGCCCAGGAAAATTTGACACCAACGCGGAGGATGGGAAGATTCTTCATGAAATGGGGGGCCACCTATCGGAATTCCTGCTGCTTTCTCTAGTAATCCTATCTGACTTCGCCCCAGAAACGGCTAGTACGTTATACCTAATCTTACACTATGCAGTCCCCCAGTCCTACGAGGAATCAGAAGATTGCGATACGAATCAGCTCAACCTAACAGTGGGACTTAGGACAGAAGATGTGGTACCATCATCAGTTTGGAATATCGGCAAATATGTGTGTGTGAGACCAGATTGGTGGCCGTATGAAACTAAGaGTGGCTCTGCTGTTTGAAGGGCAGGACAGGtCATAAAGCTAGCTCTAAGGGCACTGAGAGATTTAACTAGAGTCTGGAACAGTGCATCTACTACTGCATTCCTCATTTGCCTGATAAAAGTGTTAAGAGGACAGGTTGTGCAAGGTGTAATATGGCTGCTGCTGGTGACCGGGGCACAAGGGCGGTTGTCCTGTAAGGAAGACTACAGGTATGCTATATCATCAACCAATGAGATAGGGCCACTAGGGGCTGAAGGTCTCACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCATTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACTTAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCATTACAAAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACATTTGAACTCCTATTTGATGGGACCACCCCAGCA82 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附2GTTGAGGAAATGGGAGATGACTTTGGATTTGGGCTGTGCCCTTTTGACACAACCCCTGTGGTCAAAGGGAAGTACAACACCACTTTATTAAACGGCAGTGCTTTCTATCTAGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGCGTCATAGAGTGCACGGCAGTGAGCCCCACTACCTTGAGAACAGAAGTGGTAAAAACCTTTAAGAGAGAGAAGCCCTTCCCGCACAGAGTGGATTGCGTGACCACTATAGTAGAAAAAGAGGACCTGTTCTACTGCAAGTTGGGGGGCAATTGGACATGTGTGAAAGGCAACCCGGTGACCTACACAGGAGGGCAAGTAAAGCAATGCAGGTGGTGCGGGTTTGACTTCAAAGAACCCGATGGGCTCCCGCACTACCCCATAGGCAAGTGCATCCTAGTAAATGAGACGGGTTACAGGGTGGTGGATTCCACAGACTGCAACAGAGATGGTGTTGTTATCAGTACTGAAGGAGAACATGAGTGCTTGATCGGCAACACCACCGTAAAAGTACACGCGTTGGATGGAAGACTGGCCCCTATGCCGTGTAGACCCAAAGAGATCATCTCTAGTGCGGGACCTGTAAGGAAAACTTCTTGCACTTTCAACTATACAAAGACTCTGAGAAACAAGTACTATGAGCCTAGGGACAGCTACTTCCAGCAGTATATGCTTAAGGGAGAGTACCAATACTGGTTTGATCTGGACGTGACTGACCACCACACAGACTACTTTGCTGAATTTATTGTCTTGGTGGTAGTGGCATTATTGGGGGGAAGGTACGTTCTGTGGCTAATAGTAACCTATATAGTACTAACAGAGCAACTTGCTGCCGGTTTACAACTAGGCCAGGGTGAGGTGGTACTGATAGGAAACTTGATTACCCACACGGACAATGAGGTAGTAGTATACTTCTTACTGCTCTACCTAATAATAAGAGATGAGCCCATAAAGAAATGGATACTACTGCTGTTTCATGCCATGACCAACAACCCAGTTAAGACCATGACAGTAGCATTGCTAATGATCAGTGGGGCCGCCAAGGGTGGAAGGACAGAAGGTGGTTGGCAGAGGCAGCTAGAGACCAATTTTGACATCCAACTCGCACTGGCAGTCACAGTAGTAGTCGTGATGTTGTTGGCAAAGAGAGATCCGACTACTTTCCCCCTGGTGATCACAGTGGCGACCCTAAGAACGGCTAAGATAACCAATGGTTTCAGCACAGATCTAGCCATAGCCACAGTGTCGGCAGCTTTGCTAACCTGGACTTATATCAGTGACTATTACAAATACAAGACTTGGCTACAGTACCTCATCAGCACGGTGACTGGAATCTTCCTTATAAGGGTACTGAAGGGAATAGGCGAGTTGGACTTGCACGCCCCAACTTTACCATCTCACAGACCCCTGTTCTACATCCTTGTGTACCTCATTTCCACTGCTGTGGTAACCAGATGGAACCTGGACATAGCCGGACTGCTGCTACAGTGCGTCCCAACACTCCTAATGGTGTTTACGATGTGGGCTGACATTCTCACTCTGATCCTCGTACTACCCACTTATGAGCTGACAAAGTTATACTACCTTAAGGAAGTGAAGATCGGAACAGAAAAAGGATGGCTGTGGAAAACTAACTATAAGAGGGTGAATGACATCTACGAAGTCGACCAAGCTGGCGAGGGGGTTTACCTCTTCCCTTCAAAACAAAAGACTAGTGCTATAACGAGCACCATGTTGCCGTTGATCAAAGCCATACTCATCAGCTGCATCAGTAACAAGTGGCAACTTATATACTTACTGTACTTGATATTTGAAGTGTCCTACTACCTTCACAAGAAAGTCATAGATGAGATAGCCGGCGGGACCAATTTCGTTTCAAGACTAGTGGCAGCTTTGATTGAAGTTAATTGGGCCTTCGACAATGAAGAAGTTAAAGGCCTAAAAAAATTTTTCTTGCTGTCCAGTAGGGTTAAAGAGTTGGTCATCAAACACAAAGTGAGAAATGAAGTAGTGGCCCGCTGGTTTGGGGGTGAAGAGATCTACGGGATGCCAAAGTTGATCGGCTTAGTTAAGGCAGCAACACTGAGCAAAAGCAAACACTGTATCTTGTGCACCGTCTGTGAGGACAGAGATTGGAGAGGGGAAACTTGCCCAAAATGCGGGCGCTTTGGACCACCAGTGATCTGCGGTATGACCCTAGCAGACTTCGAGGAGAAACACTATAAGAGGATTTTTATCAGAGAGGACCAATCAGATGGGCCACTCAGGGAGGAGCATGCAGGGTACTTGCAGTACAAAGCTAGGGGTCAACTTTTTCTGAGGAATCTCCCGGTGTTGGCGACAAAAGTCAAGATGCTCCTGGTTGGTAACCTCGGGACTGAGGTCGGGGATTTGGAGCATCTTGGCTGGGTGCTCAGAGGGCCTGCCGTCTGTAAGAAGGTCACTGAACACGAAAAGTGCGCTACGTCTATAATGGACAAGTTGACAGCTTTCTTCGGTGTTATGCCAAGAGGTACTACCCCCAGGGCTCCTGTAAGGTTTCCCACTTCCCTCCTAAAGATAAGAAGAGGGTTGGAGACGGGTTGGGCTTACACACATCAAGGTGGCATTAGCTCAGTTGACCATGTGACTTGTGGGAAAGACTTGCTGGTGTGTGACACTATGGGCCGGACAAGGGTCGTTTGCCAATCAAATAATAAGATGACTGACGAATCCGAATACGGGGTCAAAACCGACTCAGGGTGCCCAGAAGGGGCCAGATGTTATGTGTTCAACCCTGAGGCAGTTAACATATCAGGCACTAAAGGGGCCATGGTCCACTTACAAAAAACTGGTGGGGAGTTCACCTGCGTAACAGCATCAGGAACCCCGGCCTTCTTTGATCTCAAGAACCTCAAGGGCTGGTCAGGGCTACCGATATTCGAAGCATCGAGTGGAAGGGTAGTCGGAAGGGTCAAGGTCGGGAAGAACGAAGACTCTAAACCAACCAAACTCATGAGTGGGATACAAACGGTCTCTAAAAGTGCCACTGACTTGACGGAGATGGTAAGGAAAATAACAACCATGAACAGGGGAGAGTTCAGACAAATAACCTTGGCCACGGGTGCTGGAAAAACTACAGAGCTCCCCAG83 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附2GTCAGTTATAGAAGAGATAGGGAGACACAAAAGGGTGTTGGTATTGATCCCCTTGAGGGCCGCAGCAGAATCAGTATACCAATATATGAGGCAGAAACACCCAAGTATAGCATTCAACCTGAGGATAGGGGAGATGAAGGAAGGTGACATGGCCACGGGGATAACCTATGCCTCCTACGGTTACTTTTGCCAGATGCCACAACCAAAACTGAGGGCTGCAATGGTAGAGTATTCCTACATCTTTCTAGATGAGTACCATTGTGCCACCCCAGAACAACTGGCCATCATGGGGAAGATCCACAGATTTTCAGAGAACCTGAGGGTGGTGGCTATGACAGCAACACCAGCGGGAACAGTAACAACCACTGGGCAGAAACACCCTATAGAGGAGTTCATTGCCCCGGAAGTAATGAAAGGAGAAGACTTAGGTTCAGAGTACTTAGACATTGCCGGACTAAAGATACCAGTAGAGGAGATGAAGAACAACATGCTAGTTTTTGTACCAACTAGGAACATGGCAGTAGAGGCGGCAAAGAAACTGAAAGCCAAAGGATATAACTCAGGCTATTACTACAGTGGTGAGGACCCATCCAACCTGAGGGTAGTTACATCGCAGTCCCCATACGTGGTAGTAGCGACCAACGCGATAGAATCAGGCGTCACTCTCCCAGACCTGGATGTGGTCGTTGACACAGGACTCAAGTGTGAAAAAAGAATCCGACTGTCACCTAAGATGCCCTTCATAGTGACCGGCCTGAAAAGGATGGCTGTCACTATTGGGGAACAAGCCCAGAGAAGGGGGAGGGTTGGGAGAGTGAAGCCCGGGAGATACTACAGGAGCCAAGAAACTCCTGTCGGCTCTAAGGACTACCACTATGACTTGCTGCAAGCCCAGAGGTACGGTATAGAAGATGGGATAAATATCACCAAATCCTTCAGAGAAATGAACTATGACTGGAGCCTCTATGAGGAAGATAGTCTGATGATAACACAACTGGAAATCCTCAACAATTTGTTGATATCAGAGGAGCTGCCGGTGGCAGTAAAAAATATAATGGCTAGGACTGACCATCCAGAACCAATTCAACTGGCGTATAACAGCTATGAGACACAAGTGCCAGTGTTGTTCCCAAAAATAAGAAATGGAGAGGTAACTGACACTTATGATAATTACACCTTCATCAATGCAAGAAAATTGGGGGATGATGTACCTCCCTATGTGTATGCCACAGAAGACGAGGACTTGGCTGTGGAACTGTTGGGCCTAGATTGGCCAGACCCTGGaAACCAAGGCACCGTGGAGGCTGGTAGAGCACTAAAACAGGTGGCTGGTCTATCGACAGCCGAGAATGCCCTGCTAGTAGCCTTATTTGGCTACATAGGGTACCAGGCCCTCTCAAAGAGGCATGTACCTGTGGTCACAGACATATATTCAGTCGAAGATCACAGGTTAGAGGACACCACACATTTACAGTACGCTCCGAATGCCATCAAGACGGAGGGAAAGGAGACTGAATTGAAGGAGTTGGCTCAAGGAGATGTGCAGAGATGTGTGGAAGCAGTGACCAACTACGCGAGAGAGGGCATCCAATTCATGAAATCACAGGCGCTGAAGGTGAGAGAAACCCCCACTTATAAAGAGACAATGAGTACTGTGGCAGACTATGTGAAAAAGTTTATCGAGGCACTATCGGATAGTAAAGAAGACATCCTGAAATATGGACTGTGGGGCGTACACACGGCCTTGTATAAGAGCATCGGTGCCAGGCTTGGTCACGAAACCGCGTTCGCAACTCTAGTCGTAAAATGGTTGGCATTTGGGGGGGAATCAATCGCTGATCACGTAAAACAAGCGGCTACAGACTTGGTCGTGTATTACATCATCAACAGACCCCAATTTCCAGGAGACACAGAGACACAACAAGAAGGGAGAAAATTCGTGGCCAGCCTACTGGTCTCAGCCCTGGCAACTTACACATACAAAAGTTGGAACTACAACAACCTGTCCAAGATAGTTGAACCGGCTTTGGCCACTCTACCCTATGCCGCTAAAGCCCTTAAATTATTTGCCCCCACCCGACTGGAGAGCGTTGTCATACTGAGCACTGCAATCTACAAAACATACCTGTCAATCAGGCGAGGCAAAAGTGATGGACTGCTAGGCACAGGGGTTAGCGCGGCTATGGAGATTATGTCACAAAACCCGGTATCAGTAGGTATAGCAGTTATGCTGGGGGTTGGGGCTGTAGCAGCCCACAATGCAATTGAAGCCAGCGAGCAGAAGAGAACATTACTTATGAAAGTCTTTGTAAAAAACTTCTTGGACCAAGCAGCCACGGATGAACTAGTCAAAGAGAGCCCTGAGAAAATAATAATGGCCCTGTTTGAAGCAGTGCAAACAGTAGGCAACCCACTTAGACTGGTGTACCACATTTACGGTGTTTTTTATAAAGGGTGGGAAGCAAAAGAGCTGGCCCAGAGAACAGCCGGCAGGAACCTATTCACCTTGATAATGTTCGAGGCTGTGGAACTACTGGGGGTAGATAGTGATGGTAAAATCCGCCAGCTGTCAAGTAACTACATATTAGAGCTCCTGCACAAGTTCCGTGATAACATCAAATCTAGTGTGAAGGAGATAGTAATCAGCTGGGCCCCAGCCCCCTTCAGTTGCGACTGGACACCAACAGATGACAGGATAGGGCTCCCCCATAACAATTACCTCCAAATGGAGACAAGATGTCCTTGCGGCTACAGAATGAAAGCAGTAAAAACCTGTGCTGGGGAGTTGAGACTGCTGGAAGAGGGAGGTTCATTCCTCTGCAGGAATAAATTTGGTAGAGGGTCACGGAACTACAGGGTGACAAAATACTATGATGACAATTTATCAGAAATAAAACCAGTGATAAAAATGGAAGGACATGTGGAACTGTACTATAAAGGGGCCACTATTAAACTGGACTTTAACAATAGTAAAACAGTGTTGGCAACCGACAAATGGGAGGTTGACCATTCCACCCTGGTCAGGGCGCTCAAGAGGTATACAGGGGCTGGATATCAAGGGGCGTATTTGGGTGAGAAACCCAACCACAAACATTTGATAGAGAGAGACTGTGCAACGATCACAAAAGACAAGGTTT84 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附2GCTTCATTAAAATGAAGAGGGGGTGTGCATTTACTTACGACTTATCTCTCCACAACCTTACCCGGCTAATCGAATTGGTACATAAGAACAACCTGGAAGATAGAGAAATCCCTGCCGTTACGGTTACAACCTGGCTGGCCTACACATTCGTGAATGAAGACATAGGGACCATAAAACCAGTTTTTGGGGAAAAGGTAACACCGGAAGAGCAGGAGGAGGTAACCTTGCAGCCTGCAGTGGTGGTGGACACAACAGAAGTAGCCGTGACCGTGGTCGGGGAAACCCCTGTTATGACCACAGGGGAGACCCCGACGGTGTTTACCAGCTTAGGATCAGACTCCAAGGTTCAACAAGTCTTGAAGCTGGGGGTGGATGGGGGTCAATACCCTGGGCCTAGCCAGCAGAGAGCAAGCTTGCTCGAAGCTATACAAGGTGTGGATGAGAGGCCCTCAGTACTGATATTAGGGTCTGATAAGGCCACCTCCAATAGGGTGAAGACCGCAAAGAATGTGAAGATATTCAGGAGCAGAGACCCCCTGGAACTGAGGGAAATGATGAGAAAAGGGAAGATCCTAGTCATAGCCCTGTGTAAGGTCGACACCGCTCTGCTGAAATTTGTTGATTACAAAGGTACCTTCCTGACCAGAGAGACCCTAGAGGCATTAAGCCTGGGTAAACCTAAGAGAAGAGACATAACCAAGACAGAGGCACGATGGTTGTTGTGCCTCGAAGACCAAACAGAAGAGCTGCCTGACTGGTTCGCAGCTACGGAGCCCATATTTCTAGAAGCCAACATCAAACGTGACAAGTACCATCTGGTGGGGGATATAGATACCATTAAAGAAAAAGCCAAACAACTCGGGGCAACAGACTCCACAAAGATATCAAAAGAGGTCGGCGCGAAAGTATATTCTATGAAGCTGAGTAATTGGGTGATGCAAGAAGAGAACAAACAGGGCAGTTTAGCCCCCTTGTTTGAAGAGCTCCTGCAACAATGCCCACCTGGGGGTCAGAATAGAACCACTCATATGGTCTCAGCTTACCAACTGGCCCAAGGGAACTGGATGCCAGTTGGTTGCCACGTGTTCATGGGGACTATACCAGCTAGAAGAACCAAGACTCATCCCTATGAGGCATATGTCAAGCTGAGGGAGTTGGTAGAGGAACATAAGATGAAGACATTATGTGGCAGTTCAGGCCTATGCAAGCACAATGAATGGGTAATTCGCAAGGTTAAGCATCACGGGAACCTAAGGACCAAACACATGTTGAACCCCGGAAAAGTTGCAGAGCAGCTACACAGAGAAGGGCACAGACATAACGTATATAACAAGACCATAGGCTCAGTGATGACAGCAACTGGTATCAGGCTGGAAAAATTACCCGTGGTCAGGGCCCAAACAGATACAACCAACTTCCATCAAGCAATAAGGGATAAAATAGACAAGGAAGAAAACCTGCAGACCCCAGGCTTGCACAAGAAGTTGATGGAAGTCTTCAATGCAtTAAAAAGACCTGAGCTTGAGGCCTCTTACGACGTTGTGGAGTGGGAGGAATTGGAGAGAGGGATAAATAGGAAGGGCGCTGCGGGTTTCTTTGAACGCAAGAATATAGGAGAAGTCTTGGATTCAGAAAAAAATAAAGTTGAAGAGATCATAGACAGTTTGAGGAAAGGTAGGAGTATCAAATACTATGAAACTGCGATCCCGAAAAATGAAAAGAGGGACGTTAATGATGACTGGACTGCCGGTGACTTTGTGGATGAGAAAAAGCCCAGGGTGATACAATACCCCGAGGCTAAAACCAGGTTGGCCATCACTAAAGTAATGTACAAGTGGGTGAAACAGAAACCAGTAGTTATACCTGGCTATGAAGGTAAGACACCCCTGTTCCAGATCTTTGACAAAGTGAAGAAAGAATGGGACCAATTCCAAAATCCAGTGGCTGTGAGCTTCGACACCAAAGCGTGGGATACCCAGGTGACTACAAGAGACCTAGAACTAATAAGGGATATACAGAAGTTCTATTTCAAGAAGAAGTGGCACAAATTCATTGACACCCTGACTATGCACATGTCAGAAGTACCCGTAATTAGTGCCGACGGGGAGGTGTATATAAGGAAGGGGCAGAGAGGCAGTGGACAACCTGACACGAGCGCAGGCAACAGCATGCTGAATGTACTAACAATGGTCTATGCCTTCTGTGAGGCCACGGGGGTGCCCTATAAGAGTTTCGACAGAGTGGCAAAGATCCACGTTTGCGGGGATGATGGTTTCTTGATTACTGAAAGGGCTCTTGGTGAGAAATTTGCGAGTAAAGGAGTCCAGATTCTATATGAAGCCGGGAAGCCCCAAAAAATCACAGAAGGGGATAAGATGAAAGTGGCCTATCAGTTTGACGACATCGAGTTCTGTTCCCATACACCAGTGCAAGTAAGGTGGTCAGACAACACTTCTAGTTACATGCCGGGGAGGAACACGACTACAATCCTGGCAAAAATGGCAACAAGGTTAGATTCCAGTGGTGAGAGGGGCACTATAGCATATGAGAAGGCAGTGGCATTTAGCTTCTTGTTGATGTACTCCTGGAACCCACTGATCAGAAGGATATGCCTACTAGTGTTGTCAACCGAACTGCAAGTGAGACCAGGGAAGTCAACCACTTATTACTATGAAGGGGACCCGATATCTGCTTACAAGGAGGTCATCGGCCATAATCTCTTTGACCTTAAAAGAACAAGCTTCGAGAAGCTAGCTAAATTAAATCTTAGTATGTCCACACTCGGGGTTTGGACCAAGCACACCAGTAAAAGATTACTACAAGACTGCGTCAACGTCGGTGCTAAAGAGGGCAACTGGTTGGTTAACGCAGACAGACTGGTGAGCAGCAAGACAGGAAATAGGTATATACCCGGAGAGGGCCATACTCAACAAGGGAAACACTATGAAGAACTGATATTGGTAAGAAAGCCGATCAGTAATTTTGAGGGGACTGATAGATATAATTTGGGTCCAATAGTCAACGTAGTGTTGAGGAGGCTGAGAGTCATGATGATGGCTCTTATAGGAAGGGGGGTGTAAGAACAGCAGGCCCTTGACCGGGCCCTACCAGTAGAACTCTGTTGTAAAT85 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附2AACACTAAATTATTATTTATTTAAATACTATTATCTATTTATTTATTTATTTATTGAATGAGCAAGTATTGGTGCAAACTACCTCACGTTACCACACTACACTCATTTTTAACAGCACTTTAGCTGGAGGGAAAATCCTGACGTCCATAGTTGGACTAAGGTAATTTCCTAACGGCCC86 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附3附6：GD19全基因组序列GTATACGAGGTTAGTTCATTCTCGTGTACAATATTGGACAAGACCAAAATTCCGATTTGGCCTAGGGCACCCCTCCAGCGACGGCCGAACTGGGCTAGCCATGCCCACAGTAGGACTAGCAAACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGGAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTGGCGGGGGTCGCCAGGGTGAAATCACACCATGTGATGGGGGTACGACCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTAATAGGCTAGTATAAAAAATCTCTGCTGTACATGGCACATGGAGTTGAATCATTTTGAACTACTATACAAAACAAATAAACAAAAACCAATAGGAGTGGAGGAACCGGTGTATGACATCGCAGGAAGACCATTTTTCGGGGACCCAAGTGAGGTACACCCACAATCAACACTGAAGCTGCCACATGACAGGGGGAGAGGTAATATCAGAACTACACTGAAGAACCTACCTAGGAAAGGCGACTGTAGGAGTGGAAACCACCTAGGACCAGTCAGTGGGATATATGTAAAACCCGGCCCTGTCTTCTATCAGGACTACATGGGCCCTGTCTATCATAGAGCTCCATTGGAGTTTTTTGAAGAGGCCCAGCTGTGTGAGGTGACTAAGAGAATAGGTAGGGTGACGGGTAGTGATGGGAAGCTTTACCACATATATGTGTGCATTGACGGTTGCATACTGCTGAAGTTAGCCAAAAGGGGCACGCCTAGATCCCTAAAGTGGACTAGGAACTTCACCGACTGTCCACTATGGGTCACTAGTTGTTCTGATGATGGCGCAGGTGGCAGCAAGGATAAGAAACCAGACAGGATGAACAAGGGTAAATTAAAAATAGCCCCAAAAGAGCATGAGAAGGACAGCAAAACCAAGCCACCTGATGCCACGATCGTGGTAGAGGGAGTAAAATACCAAGTGAAAAAGAAAGGCAAAGTCAAAGGGAAGAACACTCAAGATGGCCTATACCATAATAAGAACAAACCACCAGAGTCCAGGAAGAAACTAGAAAAAGCCCTACTGGCTTGGGCAGTGATAACAATCGTACTGTACCAGCCTGTAGCGGCCGAGAATATAACTCAGTGGAACCTGAGTGACAATGGCACAAGCGGTATCCAGCAAGCCATGTATCTTAGAGGGGTTAATAGGAGTCTACATGGGATCTGGCCTGAAAAAATATGCAAAGGGGTCCCTACTCACCTGGCTACTGATACGGAGCTGACAGAGATACGAGGGATGATGGACGCCAGCGAGAGGACGAACTATACGTGTTGCAGGTTGCAGAGACACGAATGGAATAAACATGGATGGTGTAACTGGTACAACATAGACCCCTGGATTCAATTAATGAACAGGACCCAAGCAAATCTGACAGAAGGCCCCCCGGATAAGGAGTGCGCCGTGACTTGCAGGTATGACAAAAATGCTGACGTTAACGTGGTCACCCAGGCCAGGAATAGACCAACCACTCTGACCGGCTGCAAGAAAGGAAAAAACTTTTCATTTGCAGGTACGATTATAGAGGGCCCATGCAATTTCAACGTCTCCGTGGAGGACATCCTATATGGGGACCATGAGTGTGGCAGCCTGTTCCAGGACACAGCTCTGTACCTATTAGATGGAATGACCAACACTATAGAGAAAGCCAGGCAGGGTGCGGCAAGAGTTACATCCTGGCTTGGGAGGCAACTCAGAACCACAGGGAAGAAGTTGGAGAGAGGAAGCAAAACCTGGTTCGGCGCCTACGCCCTGTCACCTTACTGTAACGTAACAAGGAAAGTGGGGTACATATGGTATACGAACAATTGCACTCCGGCATGTCTCCCAAAAAACACGAAAATAATAGGTCCAGGAAAATTCGATACCAACGCGGAAGATGGGAAGATACTTCATGAAATGGGGGGCCACCTATCAGAATTTTTGTTGCTTTCTTTAGTAATCCTGTCTGACTTCGCCCCGGAGACGGCCAGTACGCTATACCTAATCTTACACTATGCAATCCCTCAGTCCCATGAAGAGCCTGAAGGTTGCGATACGAACCAGCTCAATCTAACAGTGGGACTTAGGACAGAAGATGTGGTACCATCATCAGTTTGGAATATCGGCAAATATGTGTGTGTTAGACCAGACTGGTGGCCGTATGAAACTAAGGTGGCTTTGCTGTTTGAGGAGGCAGGACAGGTTATAAAACTAGCTCTACGGGCACTGAGAGATTTAACTAGAGTCTGGAACAGTGCATCAACTACTGCGTTCCTCATCTGCTTGATAAAAATATTAAGAGGACAGGTTGTGCAAGGTATAATATGGCTGCTGCTGGTAACTGGGGCACAAGGGCGGTTGACCTGTAAGGAAGACTACAGGTATGCGATATCATCAACCAATGAGATAGGGCCGCTTGGAGCTGAAGGTCTCACTACCACCTGGAAAGAATACAACCATGGTTTACAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCACTTGCACTGCAGGGTCCTTTAAAGTTATAGCACTTAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTGGCATCATTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTAACATTTGAACTCCTATTTGATGGGACCAGCCCAGTAATTGAGGAGATGGGAGACGACTTTGGATTTGGGCTGTGCCCTTTTGACACGATCCCTGTGGTCAAAGG87 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附3GAAGTATAACACCACCTTATTAAACGGCAGTGCTTTCTATCTAGTCTGCCCTATAGGATGGACGGGTGTTATAGAGTGCACGGCAGTAAGCCCCACAACCTTGAGAACAGAAGTGGTGAAGACCTTCAAGAGAGAGAAGCCTTTCCCTCACAGAGTGGACTGCGTGACCACTATAGTAGAAAAAGAAGACCTGTTCTATTGCAGGCTGGGGGGTAATTGGACATGCGTGAAAGGTGACCCGGTGACCTACACGGGGGGCCAAGTAAAACAATGCAGGTGGTGCGGTTTCAACTTCAAGGAGCCTGATGGGCTCCCACACTACCCCATAGGCAAGTGCATCCTAGCAAATGAGACGGGATACAGGGTAGTGGACTCCACAGACTGCAACAGAGACGGCGTCGTCATCGGCACTGAAGGAGAGCATGAGTGCTTGATCGGCAACACCACCGTCAAGGTGCACGCGCTGGACGGAAGACTGGCCCCTATGCCTTGCAGACCCAAAGAAATCGTATCTAGTGCGGGACCTGTAAGGAAAACTTCCTGCACATTTAACTATACAAAGACTTTGAGGAACAAGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATACATGCTTAAGGGCGAGTATCAATACTGGTTTGATCTGGACGTGACAGACCACCACACAGACTACTTCGCCGAGTTTGTTGTCTTGGTGGTAGTGGCACTATTAGGGGGAAGGTACGTCCTGTGGCTAATAGTGACCTATATAGTTCTAACAGAGCAACTCGCTGCTGGTTTACAGCTAGGCCAGGGCGAGGTGGTGCTGATAGGGAACTTAATCACCCACATGGACAACGAGGTAGTGGTATACTTCTTACTGCTTTACCTAATAATAAGAGACGAGCCCATAAAGAAATGGATACTACTGCTGTTCCATGCCATGACCAACAACCCAGTTAAGACCATGACAGTAGCATTGCTAATGATAAGCGGGGTAGCCAAGGGTGGGAAAATAGATGGTGGTTGGCAGAGGCAGCCGGAGACCAATTTTGACATCCAATTCGCACTGGCAGTCATAATAGTCGTCGTGATGTTGTTGGCAAAGAGAGATCCGACTACTTTTCCCCTGGTGATCACTGTGGCAACCTTGAGAACGGCTAAGATAACCAGTGGTTTCAGCACAGATCTAGCCATAGCCACAGTGTCGGCAACTTTGCTAACCTGGACTTATATCAGTGACTACTACAAATACAAAACTTGGCTACAGTACCTCATCAGCACGGTGACTGGAATTTTTCTGATAAGGGTACTGAAGGGGGTCGGCGAGTTGGACCTACACGCCCCGACTCTGCCATCCCACAGACCCCTTTTCTACATCCTTGTGTACCTCATCTCCACTGCCGTGGTAACGAGATGGAACTTGGACGTAGCCGGAATACTGCTACAGTGCGCCCCAACACTTCTAATGGTATTCACGATGTGGGCTGACATCCTCACCCTAATTCTCATACTGCCCACCTATGAGTTGACAAAGTTATATTACCTTAAGGAAGTGAAGATAGGGACTGAAAGAGGATGGCTGTGGAAAACTAATTACAAGAGGGTAAATGACATCTATGAAGTCGACCAAGCTGGCGAAGGGGTTTACCTCTTCCCTTCGAAACAAAAGACTGGAGCTATAACGAGCACCGTGTTGCCGTTGATCAAAGCCATACTCATTAGCTGCATCAGTAACAAGTGGCAATTCATATATTTACTGTACTTGATATTTGAGGTGTCCTACTACCTTCACAAGAAAATCATAGATGAGATAGCCGGCGGGACCAACTTCGTTTCGAGACTAGTGGCGGCTTTAATTGAAGTTAATTGGGCTCTAGACAATGAAGAAGTCAAAGGCCTAAAGAAGTTTTTCTTGTTGTCTAGTAGGGTCAAAGAGTTGGTTATCAAACACAAAGTGAGGAATGAAGTAATGGTCCGCTGGTTTGAAGATGAAGAGATCTACGGGATGCCAAAGCTGATCGGCCTGGTTAAGGCAGCAACACTGAGCAAAAACAAACACTGTATTTTGTGCACCGTCTGTGAGGACAGAGATTGGCGGGGAGAAACTTGCCCGAAATGCGGGCGTTTTGGACCACCAGTGATCTGTGGTATGACCCTAGCTGACTTCGAGGAAAAACACTATAAGAGGATTTTCATCAGGGAGGACCAATCAGACGGGCCGCTCAGGGAGGAGCATGCAGGGTACTTGCAGTACAAAGCTAGGGGTCAATTGTTTCTGAGGAATCTCCCAGTGTTGGCAACAAAAGTCAAGATGCTTCTGGTTGGCAACCTAGGGACAGAGGTTGGGGACCTGGAGCACCTTGGCTGGGTGCTCAGAGGGCCCGCTGTCTGCAAGAAGGTTACTGAACATGAAAAGTGTGCTACGTCTATAATGGATAAGTTGACTGCCTTCTTTGGTGTCATGCCAAGGGGTACCACCCCCAGAGCTCCTGTAAGATTTCCCACCTCCCTTCTAAAGATAAGAAGAGGGCTGGAGACGGGTTGGGCTTATACACACCAAGGCGGTATCAGCTCAGTTGACCATGTTACTTGCGGGAAAGACCTGCTAGTGTGTGACACCATGGGTCGGACAAGGGTTGTCTGCCAATCGAATAACAAGATGACTGACGAGTCTGAATACGGAGTCAAAACCGACTCAGGGTGCCCAGAGGGAGCCAGGTGCTACGTGTTCAACCCTGAGGCAGTTAATATATCAGGCACTAAAGGAGCCATGGTCCACTTACAGAAAACTGGTGGAGAATTCACCTGTGTAACAGCATCAGGGACCCCAGCTTTCTTCGATCTCAAGAACCTCAAGGGTTGGTCAGGGCTACCGATATTTGAAGCATCGAGTGGAAGGGTAGTCGGAAGGGTCAAGGTCGGGAAGAACGAAGACTCTAAACCAACCAAACTCATGAGTGGGATACAAACGGTCTCTAAAAGTGCCACTGATTTGACGGAGATGGTGAAGAAGATAACAACCATGAACAGGGGGGAGTTCAGACAAATAACCTTGGCCACAGGTGCTGGAAAAACTACAGAGCTACCCAGGTCAGTCATAGAAGAGATAGGGAGACACAAAAGGGTGCTGGTATTGATCCCCCTTAGGGCCGCAGCAGAAT88 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附3CAGTATACCAATACATGAGGCAGAAACACCCGAGTATAGCATTCAACCTGAGGATAGGGGAGATGAAGGAAGGTGACATGGCCACGGGAATAACCTATGCTTCTTATGGTTACTTTTGCCAGATGCCACAACCCAAGTTGAGAGCCGCAATGGTAGAGTATTCCTACATCTTTCTAGACGAGTACCATTGCGCCACCCCGGAACAATTGGCTATCATGGGGAAGATCCACAGATTCTCAGAGAACCTGCGGGTGGTCGCTATGACAGCGACGCCAGCAGGCACGGTAACAACTACTGGGCAGAAACACCCTATAGAGGAGTTCATAGCCCCGGAAGTGATGAAAGGAGAAGACTTAGGTTCAGAGTACTTAGACATCGCCGGGCTAAAGATACCAGTAGAGGAGATGAAGAACAACATGCTAGTTTTTGTACCAACTAGGAACATGGCAGTGGAGGCGGCAAAGAAATTGAAAGCCAAAGGATATAACTCAGGCTATTACTACAGTGGTGAGGACCCATCCAACCTGAGGGTAGTTACATCGCAGTCCCCATACGTGGTGGTAGCGACCAACGCAATAGAATCAGGCGTCACTCTCCCAGACCTTGATGTGGTCGTTGACACAGGACTCAAGTGTGAGAAAAGAATCCGACTGTCACCCAAGATGCCTTTCATAGTGACTGGCCTGAAAAGAATGGCCGTCACTATTGGGGAACAAGCCCAGAGAAGAGGGAGGGTTGGAAGAGTAAAGCCCGGGAGATACTACAGGAGCCAAGAAACTCCAGTCGGCTCTAAGGACTACCACTATGACTTGCTGCAAGCCCAAAGGTACGGTATAGAAGATGGGATAAATATCACCAAATCCTTCAGAGAGATGAACTACGATTGGAGCCTTTATGAGGAAGATAGCCTGATGATAACACAACTGGAAATCCTCAACAATCTGTTGATATCAGAGGAGCTGCCGGTAGCAGTAAAAAATATAATGGCTAGGACTGACCACCCAGAACCAATTCAACTAGCGTATAATAGCTACGAGACACAGGTACCAGTGTTGTTCCCAAAGATAAGGAATGGAGAGGTGACTGACACTTACGACAACTACACCTTCCTCAATGCAAGAAAATTGGGAGATGATGTACCCCCCTATGTGTATGCCACAGAAGATGAGGACTTGGCAGTGGAACTGTTAGGCCTAGATTGGCCAGACCCTGGAAACCAAGGCACTGTGGAGGCTGGCAGAGCACTAAAACAGGTGGTCGGCCTATCAACAGCCGAGAATGCCCTGCTAGTGGCCTTGTTTGGCTACGTAGGGTACCAGGCCCTCTCAAAAAGGCATATACCTGTAGTCACAGACATATATTCAGTTGAAGATCACAGGTtGGAAGATACAACACACCTACAGTATGCCCCGAACGCCATCAAGACGGAGGGGAAGGAGACTGAATTGAAGGAGTTGGCTCAAGGGGATGTGCAGAGATGTGTGGAAGCAGTGGCCAATTATGCGAGTGAGGGCATCCAATTTATTAAGTCACAGGCACTGAAGGTGAGAGAGACCCCGACTTACAAAGAGACAATGAATACAGTGGCAGACTATGTGAAAAAGTTCATTGAGGCACTGTCAGATAGCAAGGAAGACATCTTGAAATATGGGCTGTGGGGTGTACACACGGCCTTGTATAAGAGCATTGGTGCCAGACTAGGTCACGAAACTGCGTTCGCAACTTTAGTCGTGAAATGGTTGGCATTTGGGGGGGAATCAGTAACAGATCACATAAAGCAAGCAGCCACAGACTTGGTTGTTTACTATATTATCAACAGACCTCAATTCCCAGGGGACACGGAGACACAACAAGAAGGGAGGAAATTTGTGGCCAGCTTACTGGTCTCAGCCCTAGCAACCTACACATACAAAAGCTGGAACTACAACAGTCTGTCCAAGATAGTTGAACCTGCTTTGGCCACTTTGCCCTACGCCGCCAAAGCCCTTAAATTATTCGCCCCTACCCGACTGGAGAGCGTCGTCATATTGAGCACCGCAATCTACAAAACATATCTATCAATCAGGCGAGGCAAAAGTGATGGATTGCTTGGTACAGGGGTTAGTGCGGCTATGGAGATTATGTCACAAAATCCAGTATCAGTGGGCATAGCAGTCATGCTGGGGGTTGGGGCTGTAGCAGCCCATAATGCAATTGAAGCCAGTGAGCAGAAGAGAACACTACTAATGAAAGTCTTTGTGAAAAACTTCTTGGACCAAGCAGCCACGGATGAACTAGTCAAAGAGAGCCCTGAGAAAATAATAATGGCCCTGTTTGAAGCAGTGCAGACGGTAGGCAACCCTCTCAGACTGGTGTACCACCTATATGGAGTTTTTTATAAAGGGTGGGAAGCAAAAGAGTTGGCCCAAAGGACAGCCGGCAGGAACCTCTTCACCTTAATAATGTTCGAGGCTGTGGAACTACTGGGAGTAGATAGTGAAGGGAAAATCCGCCAGCTCTCAAGTAACTACATATTAGAGCTCCTGTACAAGTTCCGTGACGACATCAAATCTAGTGTGAGGGAGATAGCAATCAGTTGGGCCCCTGCCCCCTTCAGCTGCGACTGGACACCAACAGATGACAGAATAGGACTTCCCCATGACAATTATCTCCAGATGGAGACAAGATGTCCTTGTGGTTACAGGATGAAAGCAGTAAAAACCTGTGCCGGGGAGTTGAGACTCCTGGAAGAGGGGGGTTCATTCCTCTGCAGGAATAAATTCGGCAGAGGGTCACGGAATTATAGGGTGACAAAATATTATGATGACAACTTATCAGAAATAAAACCAGTGATAAGAATGGAAGGACACGTGGAACTGTATCATAAAGGGGCCACTTTCAAACTGGACTTTGACAACAGTAAAACAGTACTGGCAACAGATAGATGGGAAGTCGACCATTCCACCCTGATCAGGGTGCTCAAGAGGCACACAGGGGCTGGATTTCAAGGGGCGTATCTGGGTGAGAAACCCAATCACAAGCACCTGATAGAGAGAGACTGTGCAACGATCACAAAAGACAAGGTCTGCTTCATCAAAATGAAGAGGGGGTGCGCGTTCACCTATGACTTATCACTCCACAACCTTACCCGGCTAATCG89 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附3AATTGGTACATAAGAACAACCTGGATGACAGAGAAATCCCTGCCGTTACGGTCACAACCTGGCTGGCCTACACATTCGTGAATGAAGACATAGGGACCATAAAACCAGTCTTCGGGGAAAAAGTAACACCGGAGAAGCAGGAGGAGGTAGCCTTGCAGCCTGCAGTGGTGGTGGACACAACAGATGTGGCCGTGACCGTGGTGGGGGAAACCTCCACTATGACCACAGGGGAGACCCCCACAATATTTACCAGCTTAGGTTCGGACTCTAAGTTTCAACAAGTCCTGAAACTGGGGGTGGATGAGGGTCAATATCCCGGGCCCAGGCAGCAGAGAGCAAGTTTGCTCGAAGCTGTACAAGGTGTAGATGAGAGGCCCTCGGTACTAATATTGGGGTCTGATAAGGCCACCTCCAATAGGGTGAAGACCGCAAAGAATGTGAAGATATTCAGGAGCAGAGACCCCCTGGAACTGAGAGAGATGATGAGAAGAGGGAAGATCCTAATCATAGCCCTGTGTAAGGTGGACACCGCTCTGCTGAAATTTGTTGATTACAAAGGTACCTTCCTGACCAGAGAGACCCTAGAGGCATTAAGTCTGGGCAAACCTAAGAAAAGAGACATAACTAAGACAGAGGCACGATGGTTGTTGTGCCTCGAAGGTCAATTAGAAGAGCTGCCTGACTGGTTTGCAGCCAAGGAGCCCATATTCTTAGAAGCCAACATCAAACGTGACAAGTATCATCTGGTGGGAGACATAGCTACAATCAAAGAAAAAGCCAAGCAACTGGGGGCAACAGACTCCACAAAGATATCAAAAGAGGTTGGCGCGAAAGTGTATTCTATGAAGTTGAGTAACTGGGTGATACAGGAAGAGAATAAACAGGGCAGCTTAACCCCCTTGTTTGAAGAGCTCCTGCAACAGTGCCCGCCCGGGGGCCAGAATAAAACCACACATATGGCCTCAGCCTACCAATTGGCTCAGGGGAACTGGATGCCAGTTGGTTGCCACGTGTTCATGGGGACCATACCCGCTAGAAGAACCAAGACTCATCCCTACGAGGCATATGTCAAGTTGAGGGAGTTGGTGGAAGAACATAAGATGAAGACATCATGTGGCGGTTCAGGCCTATGTAAGCACAACGAATGGGTAATTCGTAAGATCAAGCATCAAGGGAACCTGAGGACCAGACACATGCTGAACCCCGGAAAGATTGCTGAGCAACTGGATAGAGAAGGGCACAGACACAATGTGTACAACAAGACCATAGGCTCAGTAATGACAGCGACTGGCATCAGGCTGGAAAAGTTACCCGTGGTTAGAGCCCAGACAGATACAACTAATTTCCACCAAGCAATAAGGGATAAAATAGACAAGGAAGAGAACCTACAGACCCCAGGCTTACACAAGAAGTTAATGGAGGTATTCAATGCATTAAAAAGACCTGAGCTTGAGGCCTCTTACGACGCCGTGGAGTGGGAGGAATTGGAGAGAGGAATAAATAGGAAGGGTGCTGCAGGGTTCTTCGAACGCAAGAATATAGGAGAGGTCCTAGATYCAGAAAAATATAAGGTTGAAGAGATCATAGACAGTTTGAAGAAAGGTAGGAGTATTAAATATTATGAAACTGCAATCCCAAAGAACGAAAAGAGGGATGTCAATGATGACTGGACTGCCGGAGACTTTGTGGATGAGAAAAAACCCAGGGTGATACAATATCCTGAGGCCAAAACCAGGTTAGCCATCACTAAAGTGATGTATAAGTGGGTGAAACAGAAACCAGTAGTCATACCCGGCTATGAAGGTAAGACACCTCTGTTCCAAATTTTTGACAAAGTGAAAAAAGAATGGAACCAATTCCAAAATCCAGTGGCAGTGAGCTTTGACACTAAAGCATGGGATACCCAGGTGACTACAAGAGACCTGGAACTAATAAGGGATATACAGAAGTTCTATTTCAAGAAGAAGTGGCACAAATTCATCGACACCCTAACCATGCACATGTCAGAAGTACCCGTGATTAGTGCCGACGGGGAGGTGTATATAAGGAAAGGGCAGAGAGGCAGTGGGCAACCTGATACGAGCGCAGGCAACAGTATGCTGAATGTGTTAACAATGGTTTATGCCTTCTGTGAGGCCACGGGGGTACCCTATAAAAGTTTCGACAGAGTGGCAAAGATCCACGTCTGTGGGGATGATGGCTTCTTGATTACTGAAAGGGCTCTTGGTGAAAAATTTGCAAGTAGAGGAGTCCAGATCCTATATGAAGCCGGGAAGCCCCAAAAAATCACTGAAGGGGACAATATGAAAGTGGCCTATCAGTTTGACGACATCGAGTTCTGCTCCCATACACCAGTGCAGGTAAGGTGGTCAGACAACACCTCCAGTTACATGCCGGGGAGGAACACAACCACAATACTGGCAAAAATGGCTACAAGGTTGGATTCCAGTGGTGAGAGAGGCACTATAGCATATGAGAAGGCAGTGGCATTCAGTTTCTTGTTGATGTACTCCTGGAACCCACTGATTAGAAGGATATGCTTATTGGTGTTATCAACTGAAATGYAAGTGAGACCAGGGAAGTCAACCACCTATTACTATGAAGGAGACCCAATATCTGCTTACAAGGAGGTCATCGGCCATAATCTCTTTGACCTTAAAAGAACAAGTTTCGAGAAGCTAGCTAAGCTAAATCTTAGTATGTCCACACTCGGGGTATGGACCAGGCATACCAGCAAAAGATTACTACAAGACTGTGTCAATGTCGGCACCAAAGAGGGCAACTGGCTGGTTAACGCAGACAGACTGGTGAGTAGTAAGACAGGGAATAGGTATATACCTGGAGAGGGTCATACCCAACAAGGAAAACATTATGAAGAGCTGGTATTGGCAAGAAAACCGACCAGTAATTTTGAAGGGACTGATAGATATAATTTGGGCCCAATAGTCAACGTAGTGTTGAGGAGGCTGAGAGTCATGATGATGGCTCTTATAGGAAGGGGGGTGTGAGAGCGGCCGGCTCTTGACCGGGCCCTATCAGTATAACCCTGTTGTAAATAACACTAACTTATTATTTATCTAGACACTACTATTTATTTATTTATTTATTTATTGAATGAGCAAGGAATGGTACGAACTA90 吉林农业大学博士（硕士）学位论文附3CCTCATGTTACCACACTACACTCATTTTAACAGCACTTTAGCTGGAGGGAAAATCCTGACGTCCACAGTTGGACTAAGGTAATTTCCTAACGGCCC91 吉林农业大学硕士学位论文作者简介作者简介姓名谢晓明性别男民族汉籍贯白城市政治面貌团员入学时间2012-09论文答辩日授予学位申请学位类别农学硕士2015-052015-06期年月就业信息就业单位就业单位性质就业单位地址联系方式（个人/办公）学习（工作）经历2008.9至2012.6北华大学生物科学专业2012.9至2015.6吉林农业大学动物科学技术学院预防兽医学专业攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息署发表情况题目刊物名称（级别）署名单位名(刊出时间/录用)猪瘟病毒2.1b基因发表学术论文亚亚型野毒株的体吉林农业大学学报外细胞传代适应与1吉林农业大学录用（省级核心期刊）全基因组序列分析达署获奖名称成果级别署名单位发表情况名项目及专利92 吉林农业大学硕士学位论文致谢致谢古来十年寒窗扬天下，而今二十余载苦读，将是何如？弹指间，我已在吉林农业大学求学三年，键盘敲击百余字后，我的硕士学习生涯即将在这个夏天落幕，这三年求学生涯在师长、同学、亲人的大力支持下，走的辛苦也满囊收获。在论文即将付梓之际让我把最真诚的敬意和感谢献给每一个帮助过我的人。首先我要急切把我的敬意和赞美献给我的导师王全凯教授，先生温文尔雅、学识渊博、思维创新、视野熊阔、平易近人。衷心感谢恩师对我的谆谆教诲和悉心关怀，在硕士生涯中对我学习和生活中无微不至的关心。恩师不仅引领我从一个20郎当岁的毛头小子步入科学研究的殿堂，从先生身上学到的还有积极向上的乐观生活态度，虚若怀谷从善如流的处事原则。在先生身上我真切的感受到了一位学者的高贵品质和一位老师的大爱无边。再次感谢恩师对我多年来的关爱和培养，您的一言一行将使我受用终生。本实验是在军事兽医研究所涂长春研究员的指导下完成的，恩师从论文选题、实验设计、论文撰写等方面倾注了大量心血，给予了方方面面的指导和帮助，在这里我要由衷的感谢恩师对我的悉心关照。两年前使我能有幸拜读涂老师门下，这份难得的师生情缘我将永远铭记。这两年，恩师心无旁骛潜心治学的科研态度，刻苦钻研以及活跃的科学思维深深影响着我。师者，所以传道授业解惑者也，恩师正是身体力行诠释着这句古话。最后，也许只有“谢谢”这两个再简单不过、平淡无奇的字眼才能表达我心中深深的敬意。感谢龚文杰博士后对我实验和生活中的孜孜教诲和精心培养。感谢师兄带我93 吉林农业大学硕士学位论文致谢走进分子病毒学这一神奇的世界，让我领略到分子生物学的魅力，找到学习和科研的乐趣。师兄对科研忘我的钻研态度、深厚的学术造诣让我耳闻目染，万分钦佩。在这里还要感谢师兄这两年来对我的包容，包容我的肤浅和无知，你在做人、做事、做学问上给我树立了一个标榜。最后祝君在美国学习顺利，早成一家之言。感谢郭焕成副研究员、冯烨副研究员、刘艳副研究员、何彪副研究员在学习和生活中给予的关心与帮助。特别感谢冯烨老师，在我们有团队活动时无私的提供专车接送服务。特别感谢彪哥和青青姐在我考驾照时给予的各种帮助和蹭车。感谢么乃全师兄、王春雨师兄、薛立刚师兄和王蒙师姐在我硕士生活中对我的启蒙与教育，是你们的逆耳良言让我在以后的学习和科研生活中少走了许多弯路。在实验和论文完成之际除了老师的指引也离不开师兄弟姐妹的帮助、鼓气和加油，在这里，我十分有幸与曹永国博士后、蒋大良博士后、谢金鑫博士、杨知博士、凃忠忠博士、徐琳博士、夏乐乐硕士、张莉硕士、千莎莎硕士、于明洋硕士、李兴宇硕士、贾俊杰硕士、许炜迪助理、李文静助理等有同门之谊，感谢你们在我实验和生活中的关心和帮助。特别感谢我的室友谢金鑫博士在我学习和实验上的帮助，以及对我打鼾的忍耐。特别感谢张莉硕士、许炜迪助理对我实验和生活上无私的帮助。感谢王素珍阿姨和信秀芹阿姨对我生活上无微不知的关心，是你们让我在这个实验室感受到了家的温暖。感谢刘红娜师姐、杨宇航师兄、李建明师兄、王文玉师姐、张云师姐在研一生活中给予的关心和帮助，愿你们一切都好。独学而无友，则孤陋而寡闻。三年里我有幸认识了宫上舒硕士、李金龙硕士、94 吉林农业大学硕士学位论文致谢孙凡婷硕士、张武超硕士、靳红亮硕士、蔡若鹏硕士、李雨辰硕士、陈星硕士，他们在科研和生活中给了我各种帮助，与他们朝夕相处中建立的深厚友谊也将让我终身难忘。最后，特别感谢我的父母，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报。二十几年总是一味索取竟无以为报，每思及此，痛心疾首。感谢你们这些年来不计回报一直默默支持我，鼓励我，给予我最强大的动力，在我迷茫之际，不如意之时做我最强大的避风港。孝子之至,莫大乎尊亲，你们是我永远的牵挂，永远最爱的人，我会用我下半生为你们去奋斗。骊歌就要奏起，而曲终人散后，不管我是笑着，或是哭泣着与你们道别，我都庆幸能够曾经与你们同台。这三年虽然短暂但也充实，虽然忙碌却也惬意，在我的人生履历中将占据不可或缺的位置。我是幸运的，得到了这多人的教导、关心、支持、帮助、鼓励，谢谢你们。谢晓明2015年春95