猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析

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分类号密级华中农业大学硕士学位论文猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析Cloningandfurthersequenceanalysisofthecompletegenomeofporcineepidemicdiarrheaattenuatedvaccinestrain研究生学号指导教师指导小组：王晓飞：2010302110163：何启盖教授：曹胜波教授方六荣教授刘正飞教授吴斌教授肖少波教授专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2013年6月华中农业大学动物科学．动物医学院二O一三年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文否如需保密，解密时间年月日是否保密独创性翩I删嬲本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指-9教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：王日灸飞时间：zof弓年多月2—7日。f学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文(印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书．学位敝储馘工日挑导师摊憾签名日期．勃阱，月1日签名日期．如多年r月吵日注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．iAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯iii缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．v1．文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1猪流行性腹泻概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1．1猪流行性腹泻的危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．2PEDV的病原特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．3PEDV的培养特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1．4PED的流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．1．5PED的诊断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．1．6PED的治疗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．2PEDV的基因组和主要蛋白的分子特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．2．15’UTR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61．2．2OI讧1⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．2．3S蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．2．4ORF：；⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2．5M蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．2．6E蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．2．7N蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1O1．2．83’UTR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．3PED疫苗的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．3．1灭活疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“1．3．2弱毒疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．3．3基因工程疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．3．4核酸疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．3．5转基因植物疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．4冠状病毒感染性克隆研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．研究目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．153．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．163．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．1．1PEDV毒株、菌种和质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．163．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．1．3主要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16T 华中农业大学2013届硕士学位论文3．1．4缓冲液及培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．1．5本试验用的引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．183．2．1PEDV疫苗毒株的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．183．2．2PEDV疫苗株全长eDNA的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯．．223．2．3PEDVN基因的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．2．4疫苗毒株全基因组、S、ORF3、M、N基因的序列分析比较⋯⋯⋯254．结果及分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．284．1PEDV疫苗毒株的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．284．2pMD．18T-M重组质粒鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．284．3PEDV全长eDNA的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．304．4体外转录和体内转录5’端和3’端的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．344．4．1体外转录的PEDV5’端和3’端的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯344．4．2体内转录的PEDV5’端和3’端的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯354．5PEDVN基因的真核重组质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯364．6疫苗毒株的基因组结构及分子特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．374．7疫苗毒株S基因的分子特征及序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．384．8疫苗毒株OFR3基因的分子特征及序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．424．9疫苗毒株M基因的分子特征及序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯454．10疫苗毒株N基因的分子特征及序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．475．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．495．1疫苗毒株的同源性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．495．2关于疫苗毒株与参考毒株的全序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．495．3关于S基因的序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．495．4关于ORF3的序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．505．5关于M基因的序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯505．6关于N基因的序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l5．7关于PEDV感染性克隆的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．526．结{念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．65II 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析墒季猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪流行性腹泻(PED)的病原，也是猪重要的肠道病原之一；本病以引起猪的急性水样腹泻、呕吐和迅速脱水为主要特征，5日龄内的仔猪感染后死亡率可达100％。因此，我国大部分猪场都会用疫苗来预防PED。但是，从2010年以来，PED突然在我国南方地区暴发并迅速传播到全国各地，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失，而疫苗在这次的PED流行中并没有给猪群应有的保护。为了揭示猪场PED弱毒疫苗免疫失败的原因，本试验从广东、广西和湖北的3个规模化猪场得到了3株PED弱毒活疫苗，首先对3株疫苗毒株进行M基因的测序，结果显示3株疫苗毒株有两个疫苗毒株的序列完全一样，另一个毒株有1个核苷酸的突变，说明3株疫苗毒株来源相同。我们选取其中一株疫苗毒株，进行基因组全序列测定，并分析疫苗毒株与流行毒株的全序列、S、M、N、ORF3的核苷酸和氨基酸的序列差异，从基因水平上分析猪场免疫失败的原因。遗传进化结果显示，无论在全基因组水平还是在各个基因水平，疫苗毒株与目前流行毒株的亲缘关系都很远。在全基因组水平，疫苗毒株与目前流行毒株的同源性为97．1％～97．2％；在三个结构基因S、M、N的水平上疫苗毒株与目前流行毒株的核苷酸(氨基酸)同源性分别为93．7％-95％(92‰93．4％)、97‰98．7％(97．3％-98．6％)、95．7％0,--97．3％(95．9％--97．5％)。由此可以看出疫苗毒株与流行毒株的核苷酸同源性很低，从一个方面说明弱毒疫苗不能很好的保护仔猪免受流行毒株的感染。分析疫苗毒株和流行毒株的主要免疫原性基因发现，在S基因预测的受体结合位点和诱导机体产生中和抗体的关键区域，疫苗毒株和流行毒株都有氨基酸的突变，在M基因和N基因内部，流行毒株相对于疫苗毒株也有很多氨基酸位点的突变，预测这些位点的突变可能造成了流行毒株毒力的增强或者造成PEDV抗原性发生变化，从而造成了PEDV弱毒疫苗对PED流行毒株免疫失败。通过PEDVM基因和N基因的进化树、核苷酸和氨基酸的序列比较发现，以中国2004年的毒株JS一2004—2为代表的PEDV毒株与近两年流行的PEDV变异毒株在进化关系和同源性方面都很接近，说明他们之间的亲缘关系很近，由此可以推测PEDV的变异毒株可能很早就在我国的猪场存在。我国目前的流行的PED变异毒株很有可能就是由这些毒株进化来的。推测在2010年之前，这些毒株可能只是在很小的区域存在，加上PEDV引起的临床症状和病理变化与TGEV很相似，这些变异毒株被忽略了，随着地区间猪场的交流增多，变异毒株在全国传播，才造成2010年以来的PED在我国暴发。 华中农业大学2013届硕士学位论文感染性克隆是研究RNA病毒致病机理的理想工具，用于感染性克隆的病毒，最好是适应细胞的病毒。本实验以PEDV弱毒疫苗毒株为基础，构建了覆盖PEDV基因组全长的重组质粒，以及用于体内转录的5’端(含CMV启动子)和3’端(含polyA+HDV核酶+BGH+polyadenylation序列)以及体外转录所需要的5’端(含T7启动子)和3’端(含polyA)，为PEDV感染性克隆的构建打下基础，并且在构建重组质粒的过程中引入突变位点，以区分转录获得的病毒和亲本毒株，在构建重组质粒的过程中还突变了一个基因组内部的NotI限制性酶切位点，从而保证获得的全长cDNA，可以插入到BAC载体中。关键词：猪流行性腹泻；弱毒活疫苗；序列分析；遗传进化分析；全长cDNA 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析AbstractPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)isoneoftheimportantporcineentericpathogens，anditCancauseporcineepidemicdiarrhea(PED)．TheclinicalsymptomsofPEDarecharacterizedbyacutewaterydiarrhea,vomiting，dehydration，leadingtoahighmortalityrate(upto100％)inpigletwithin5days．’MostpigfarmsusedvaccinetoprotectpigsfromPEDVinfectioninourcountry．Butsince2010，PEDwasoccurredinthesouthofChinasuddenly,thenspreadtomostotherprovincesquickly,theimmunized．swinebreedingfarmscouldnotavoid，resultinlargeeconomiclossestothepigindustry,andthevaccinedidnotgivethepigfarmeffectiveprotection．Inordertoexplainwhytheattenuatedlivevaccinehadloweffectiveprotection，threeattenuatedlivevaccinesweregotfromthreepigfarmsindifferentprovinces．Atfirst，Mgeneofthesevaccineswereclonedandsequenced，andtheresultrevealedthatthesequencesofthethreevaccinesatecompletelysame，exceptoneofthemhasonlyonemutation，whichsuggeststhatthethreevaccineshavethesameorigin．ThenoneofthethreevaccinestrainsWaschoosedtosequencedthecompletegenome，andthenucleotidesandaminoacidsdiversitybetweenthevaccinestrainandprevalentstrainswereanalysedonthecompletegenomelevelandthemainstructureandnon-structuregene(S，M，N，ORF3)level，tryingtofindthereasonswhyattenuatedlivevaccinefailedforPEDVimmuneongenelevel．Thephylogeneticanalysisshowedthatnomatterfromthecompletegenomelevelorthemaingeneslevel，thevaccinestrainhasfarrelationship晰tlltheprevalentstrainsortheSOcalledvariantstrainsfrom2010．ThecompletegenomesequencehomologyofthePEDVvaccinestrainandprevalentstrainsis97．1％～97．7％；formthethreestructuregenesS，M，Nlevel，thenucleotide(aminoacids)homologyofthevaccinestrainandprevalentstrainsate93．7％-95％(92％-93．4％)，97％～98．7％(97．30／o'98．6％)，95．7％-97．3％(95．9％--97．5％)respectively．Theseresultsrevealthatthevaccinestrainhaslowidentity丽mprevalentstrains，andthismaybeoneaspecttoillustratewhyvaccinecouldnotprotectthepigfromprevalentstrainsinfection．Theresultsoftheanalysisofmainimmunogenicitygeneofthevaccinestrainandvariantstrainsshowedthatthereatemanyaminoacidmutationsinthepredictingreceptorbindingdomainandtheregion(COE，SD)thatinducetoproduceneutralizingantibodies．ForthetwoconservativegeneMandN，thereatealsomanyaminoacidsmutationsamongthevaccinestrain，referencestrainsandvariantstrains，anditCanpredictthatthesemutationsmayenhance 华中农业大学2013届硕士学位论文thevirulenceoftheprevalentstrainsorchangetheantigenicityofthevirus，thismaybethereasonthatattenuatedlivevaccinecouldnotprotectpigsfromprevalentPEDVstrainsinfection．Inaddition，fromtheanalysisofthephylogenetictreeandthenucleotidesandaminoacidsidentitiesofMgeneandNgeneamongallPEDVstrains，wecanfindthattheJS·-2004··2strainisolatedin2004whichWastakingasanexampleoftheChinesestrainsthatisolatedbefore2010，hasacloserelationship丽mtheprevalentPEDVstrains，nomatterfromphylogeneticanalysisorthesequenceidentities．ItsuggestedthatthePEDVvariantstrainsmayexistinthepigfarmintheearlytime．AndtheprevalentPEDVstrainsmaybeevolvefromthesestrains．Butbefore2010，thesevariantsmaybejustexistinasmallarea,andforthesameclinicalsymptomsbetweenPEDandTGE，thevariantPEDVstrainswereignored．W油theexchangeofdifferentpigfarms，variantPEDVspreadtothewholecountry,andthencausethePEDVoutbreaks．InfectiouscloneisaperfecttooltostudytheRNAvirus，andthecelladaptedvirusmaybebettertoconstructinfectiousclone．ThisstudyplannedtousethePEDVvaccinestraintoconstructtheinfectiouscloneofPEDV．WehaveconstructedtherecombinationplasmidsthatcoverthefulllengthofthePEDVcompletegenomeandthe5’and3’terminalforinvivoandinvitrotranscription．andlaidthefoundationfortheconstructionofPEDVinfectiousclone．Inthecourseofconstructingrecombinationplasmids，somemutationswereintroducedintentionally,todistinguishwhethertheRNAistranscribedfromthefull-lengtheDNAorfromtheparentvirus，andtheNotIrestrictionenzymesitethatlocatedinthePEDVgenomeWasalsomutated，whichensurethefull-lengthcDNACaninsertintotheBACvector．Keywords：porcineepidemicdian'hea；attenuatedlivevaccine；sequenceanalysis；phylogeneticanalysis；full-lengthcDNA 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析缩略词表V 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析1．文献综述1．1猪流行性腹泻概述1．1．1猪流行性腹泻的危害猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种猪的高度接触性传染病，感染猪以急性肠炎、水样腹泻、呕吐为主要特征。不同年龄阶段的猪都可感染，本病对初生仔猪的危害最大，5日龄以内的仔猪，由于腹泻和呕吐而造成的严重脱水，发病率和死亡率可达100％；断奶仔猪感染后临床表现为呕吐和厌食，症状可持续6～8天，死亡率大约在2％左右；育肥猪感染后表现为厌食和腹泻，症状持续6~7天后就可恢复正常；成年猪仅表现为精神沉郁、呕吐或厌食，如果没有继发其他疾病，则很少发生死亡。剖检可见病猪胃内为空的或者充满未消化的凝乳块；小肠内充满淡黄色的液体，严重时可造成空肠和回肠黏膜萎缩、脱落，肠壁变薄，呈透明状，有时可见小肠黏膜有出血点，肠系膜淋巴结水肿，严重的病例可见空肠和回肠的绒毛脱落甚至消失；其他组织器官则没有肉眼可见的病理变化。1．1．2PEDV的病原特性PEDV属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、洳冠状病毒属(Coronavirus)。根据基因组结构、遗传学和血清学的差异，可将冠状病毒属的成员分为三个群。第一群：a．冠状病毒是哺乳动物病毒，包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、人冠状病毒(HCoV229E)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和猫肠道冠状病毒(FECV)等；第二群：p．冠状病毒也是哺乳动物病毒，包括小鼠肝炎病毒(MHV)、牛冠状病毒(BCoV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)和人的严重急性呼吸综合征病毒(SARS．CoV)等，旺．冠状病毒与D．冠状病毒的区别是，后者构成病毒囊膜上有血凝素酯酶(HE)；第三群又称为丫一冠状病毒，属于禽类病毒，包括传染性支气管炎病毒(IBV)和火鸡蓝冠病病毒(Bluecombvirusofturkey)。冠状病毒科的另一个属是凸隆病毒属(Torovirus)，包含马凸隆病毒和牛凸隆病毒两个成员。套式病毒目还包括动脉炎病毒科(Arteriviridae)，这个科只有一个病毒属，即动脉炎病毒属，包括马动脉炎病毒(EAV)、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PI汛SV)、乳鼠脱氢酶病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)等成员(陆承平2001)。PEDV形态多为球形，粪便中的病毒呈现多态性，直径90～190nln，平均130nm，囊膜周围有18-23nlTl的花瓣状纤突，向四周放射，呈皇冠状，故称为冠状病毒。PEDV 华中农业大学2013届硕士学位论文的抵抗力不强，对乙醚和氯仿敏感，适应细胞后的病毒，在60℃，30min就会失去感染力，但是能在50℃的环境中存在更长的时间，4。C、pH5．0～9．0和37℃、pH6．5～7．5的环境下都能稳定存在：PEDV没有凝血活性(SongDandParkB2012)。1．1．3PEDV的培养特性PEDV被证实以后，人们先后尝试用猪肾传代细胞(PK．15)、仓鼠肾传代细胞(BHK)、猪小肠绒毛上皮细胞(IPEC)等细胞系去分离本病毒，但是都没有获得成功(钱永清等1999)。直到1988年，Hofmann才在非洲绿猴肾细胞(Vero)上获得了一株适应细胞的PEDV(HofmannMandWylerR1988)。随后日本、韩国也成功用Vero细胞分离到PEDV，我国学者于1993年也用Vero细胞成功分离到PEDV(钱永清等1999；李树根等1993)。PEDV的培养对培养基有一个特殊的要求，需要维持液中有胰酶的存在。胰酶对于很多囊膜病毒的进入靶细胞的过程中都发挥有重要的作用(KidoHetal2007)。胰酶在PEDV进入细胞和病毒粒子的释放过程中都发挥重要的作用(ShiratoKetal2011；ParkJEetal2011)。PEDV与细胞上的受体结合后，诱导S蛋白的构型发生变化，暴露S蛋白中的胰酶切割位点，然后S蛋白被胰酶切割，切割以后S蛋白的构型发生变化，激活病毒与细胞的融合，从而介导病毒进入细胞。韩国学者的研究表明，胰酶的切割作用只对粘附在细胞表面的病毒起作用，胰酶也不是PEDV感染细胞所必需的，但是却可以增强病毒对靶细胞的感染力，也可以加快CPE的产生，导致多核体的形成(细胞病变)，在传几代以后还能够显著的增加病毒的滴度(ParkJEetal2011)。1．1．4PED的流行病学本病主要发生在冬、春寒冷季节。传播途径主要是直接接触传播，粪．口途径是该病的主要传播途径。病猪、受病毒污染的水源和饲料、消毒不彻底的带毒车辆等都可能把病毒带到未感染的猪群。有报道说，在带毒母猪的乳汁中也能检测到病毒存在(SunRQetal2012)，本实验室在临床样品检测过程中也从母猪乳汁中检测到过PEDV，这为本病毒清除带来了新的困难。集约化养殖规模的不断扩大，给该病的传播创造了有利条件。1971年PEDV首先出现在英国猪场的育肥猪群中，当时的PEDV被称为EDV，与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)一样，都是以引起猪的急性水样腹泻为特征，但是与TGEV和其他猪肠道病原不同的是，EDV对未断奶的仔猪(4～5日龄以内)几乎没有影响，根据这个特征可以将EDV与TGEV区分，此种病毒被称为EDV1型(Anonymous1972)。1976年人们又发现另一种可导致所有年龄阶段的猪都发生急性腹泻的EDV，为了区分EDV1型，这种病毒被称为EDV2型(WoodEN1977)。2 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析1977年，在比利时的猪场突然暴发了一种腹泻疾病，所有年龄段的猪均发病，不同猪场的母猪发病率不同，并且经过3~4天的腹泻后，母猪会自然痊愈，但是7日龄以内的仔猪感染后由于腹泻而死亡，死亡率接近50％，随着日龄的增长，死亡率逐渐下降。人们收集不同猪场的腹泻样品，在电子显微镜下观察到了类似冠状病毒的病毒样粒子，他们将其中一份样品命名为CV777，用作深入的研究。通过动物回归试验，复制到了相同的临床症状，并且在复制出病例的腹泻样品中也检测到了冠状病毒样粒子；通过免疫荧光实验、抗体中和试验和病毒的培养特征等排除了猪的另外两种冠状病毒(TGEV和HEV)感染，确认这是一种新的可以导致猪腹泻的冠状病毒(PensaertMBanddeBouckP1978)。随后Debouck用CV777接种仔猪和育肥猪，也得到了相同的结论，再次证实了此病毒不是TGEV和HEV(DebouckPandPensaertM1980)，此后EDV作为一种新的病毒被正式命名为PEDV。英国学者于1981年(DebouckPetal1981)首次报道了PEDV的致病性；随后韩国的学者也报道了PEDV韩国株的致病性(KimOandChaeC2003)。自PEDV被发现以来，迅速在欧洲传播开来。尽管PEDV首先在欧洲发现，但是目前却对亚洲国家的影响与日俱增，包括中国、泰国、韩国、日本等，给这些国家的养猪业造成了巨大的经济损失(SongDandParkB2012)。在我国，1973年上海某猪场的猪群中出现一种以急性腹泻为特征的疾病，当时被认为是TGEV感染，直到1983年上海市农科院畜牧兽医研究所才证实此病毒不是TGEV而是PEDV(上海市农科院畜牧兽医研究所猪传染性胃肠炎病课题组1983)。1984年，宣华等再次证实，在我国猪群分离的类似TGEV的华毒(上海)和吉毒(吉林)是PEDV，进一步证明我国的猪群中存在PEDV(宣华等1984)。此后，PEDV一直在我国的猪群中存在，由于当时中国的特殊养殖模式和后来有效的疫苗控制，本病没有在猪群中造成大规模的暴发。从2010冬季开始，我国南部许多省份的猪场突然大规模的暴发猪的腹泻病，并迅速蔓延至全国各个省份和地区(ChenJetal2010；SunRQetal2012；ChenFetal2012；LiWetal2012；LiZLetal2012；ChenJetal2012)。这次腹泻病的临床症状表现为仔猪的急性腹泻并迅速的由于脱水而死亡，仔猪死亡率可高达100％，给养猪业造成了巨大的经济损失。最终经过试验证实这次腹泻病的病原是变异了的PEDV，直到目前为止PED仍然没有得到有效地防控，本病依然是我国冬季猪群危害最严重的疾病之一。1．1．5PED的诊断为了更好地防控PED，必须有一种快速、有效的检测病毒的方法。临床症状和组织病理变化是诊断任何一种疾病的第一步，但是临床症状和组织病理变化甚至显微病变的观察结果都不是特异性的。由于肠道病原造成的临床症状和病理变化十分 华中农业大学2013届硕士学位论文相似，特别是对于TEGV与PEDV两种病毒，通过临床症状和病理变化几乎不能区分。所以要想确诊PEDV，必须要借助实验室诊断。可用于诊断PED的方法有RT-PCR、RT-LAMP、ELISA、血清中和试验、免疫荧光检测、免疫组化试验、原位杂交试验、免疫电镜和免疫层析法等。不同检测方法的使用范围不一样，都有自己的优势。RT-PCR是检测PEDV最常用的方法，具有简单、快速、检出效率高的优点。但是最开始的时候RT-PCR的检测效果并不是很理想，因为小肠中的胆红素和胆盐可能抑制DNA聚合酶的活性，从而不能有效地检测出病毒(GuscettiFetal1998)，随着技术的发展现在已经不存在这样的情况了。M基因是PEDV的保守基因，所以基本上所有针对PEDV的RT-PCR检测都是基于M基因设计引物扩增出相应的特异性片段。根据TGEV、PEDV和RV三种猪腹泻病毒的基因特点而设计的多重RT-PCR还可以一次性快速、准确的区分这三个病毒(张坤和何启盖2010；SongDSetal2006)；RT-LAMP也是检测PEDV的一种方法，需要设计4-6对引物，扩增PEDV的6～8个片段，并且这个方法的特异性和敏感性都比RT-PCR和ELISA要好(RenXandLiP2011)。免疫层析法是能够在猪场直接使用的检测方法，主要针对PEDV的S蛋白，敏感度和特异性虽然都没有RT-PCR高，但是检测速度很快，十分钟就可以出结果，这也是这个方法的优点。血清中和试验(serunlneutralizationtest，SN)是实验室用来检测血清PEDV抗体最常用的方法，灵敏性和特异性非常高，是检测血清中抗体的金标准，SN既可以检测IgG还可以检测IgM，但是SN是一种费时、费力的检测方法，所以SN不适合大批量的检测血清中的抗体；早在1982年人们就研发出检测PEDV的ELISA检测方法(CallebautPetal1982)，随后通过对PEDV抗原的修饰后，开发了检测PEDV抗体的间接ELISA方法(HofmannMandWylerR1990；vanNieuwstadtAPandZetstraT1991)，1995年Carvajal又报道了PEDV的阻断ELISA检测方法(CarvajalAetal1995)；2002年，Kim比较了RT-PCR，免疫组化和原位杂交法三种PEDV检测方法，结果表明这三种方法都可以独立用作PEDV的准确检测，尽管RT-PCR检出率要高于另外两种方法，但是原位杂交和免疫组化试验可以准确地检测出由PEDV造成的肠炎，并且如果检测的样品是经过福尔马林浸泡过的组织，不能用RT-PCR方法检测，此时就只能用原位杂交和免疫组化进行检测了(KimOandChaeC2002)；2005年，韩国学者比较了PEDV的间接ELISA和SN的敏感性，结果显示，ELISA的敏感度为89．1％。特异性为94．5％，ELISA和SN结果的相似性为84．2％。并且ELISA方法简单、快速、并且适合大批量血清样品的检测，所以ELISA是一种非常有效地猪群抗体水平的血清学检测方法(OhJSetal2005)。4 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析1．1．6PED的治疗在欧洲爆发PED期间，人们采用将感染PEDV死亡小猪的肠内容物处理后饲喂给母猪的方法来治疗PED，这种人工刺激产生机体免疫的方法可以缩短疾病爆发的时间，但是这种方法有很多缺点，一是肠道内容物中PEDV的滴度不高，二是返饲可能让动物感染其他疾病，比如PRRS、PCV等(SongDandParkB2012)。Kweon报道，用抗PEDV的卵黄抗体IgY，可以显著提高感染仔猪的存活率(KweonCHetal2000)。Pyo用大肠杆菌表达了能够中和PEDV毒力的单克隆抗体ScFvs，体外实验显示，ScFvs可以阻止PEDV进入细胞内，因此这种方法可以作为一种新型的治疗PED的方法(PyoHMetal2009)。表皮生长因子(EGF)能够刺激小肠隐窝上皮细胞的有丝分裂，还能促进胃肠黏膜的恢复，试验表明EGF能够促进小肠隐窝上皮细胞的增殖，因此能够促进PEDV感染猪的恢复，为治疗提供了一个新的方法(JungKetal2008)。槲黄素7．鼠李糖苷(Quercetin7-rhamnoside，Q7R)可以通过干扰PEDV的复制，影响病毒的早期感染，从而也具有抗PEDV的活性，Q7R还具有抗TGEV的活性，但是效果不如对PEDV明显。其他类似Q7R的药物也具有微弱的抗PEDV活性(ChoiHJetal2009)。目前除了返饲，其他的治疗方法只是停留在实验室阶段，还未能大规模的在猪场使用。1．2PEDV的基因组和主要蛋白的分子特征PEDV是有囊膜的、单股正链RNA病毒，也是目前最大的RNA病毒之一，基因组大小约为28kb，根据NCBI己公布的16株PEDV全基因组序列，PEDV基因组大小(不含polyA)在27931bp(DRl3弱毒株)-28047bp(GD．01毒株)之间。PEDV的基因结构(图1—1)与其他的冠状病毒属成员相似，5’端有帽子结构，3’端有polyA尾巴。整个基因组有7个开放阅读框(openreadingframe，ORF)，其中编码3个非结构蛋白(ORFla、ORFlb和ORF3)和四个结构蛋白[S(spike)蛋白，E(envelope)蛋白，M(membrane)蛋白和N(nucleocapsid)蛋白】。整个基因组从5’到3’依次为5’UTR．OI江l(ORFla和OI冰lb)．S．ORF3．E．MON．3’UTR。其中ORFl位于5’端，占据了大约74％的基因组；4个结构蛋白S、E、M、N和一个非结构蛋白ORF3位于3’端。PEDV每个基因的上游都有一个共同的由六个核苷酸构成的基序XUA(A／G)AC，例如DRl3毒株的ORFl、ORF3、E、S、M和N基因的起始密码子ATG上游的85、46、10、8、11、15位分别为CUAGAC、CUAGAC、CUAGAC、GUAAAC、AUAAAC、和CUAAAC；类似的基序在所有的冠状病毒都普遍存在，这些序列被认为是冠状病毒亚基因组mRNAs转录的起始位点(ParkSetal2007：ChenJeta】201】)。 华中农业大学2013届硕士学位论文PEDVGenome5'O15柏25xu^l傺J^c+。．ORFtaos。d”NORF'boRF3¨mDkt‘_—_—_I—·——ll_、·_l_l·—_产l_—I^l_L'图1-1：PEDV的模式图及基因组结构(SongDandParkB2012)Fig．1-1ThemodepatternandgenomeconstructionofPEDV1．2．15’UTRPEDV基因组5’端都具有甲基化的帽子结构，目前还不清楚帽子结构对病毒的翻译和复制是不是必需的。PEDV基因组的5’UTR长292bp，5’UTR被证实并不是完全的“非翻译区”，5’UTR中包含一段有AUG诱发的短的ORF，长度为39bp，编码12个氨基酸。其他冠状病毒也有相似的结构，编码3～11个氨基酸(BrianDAandBadeRS200505’端短的ORF会对后面的ORF的翻译产生显著的增强和抑制作用，虽然它的序列大小和氨基酸序列都不保守，但是它依然会对基因的复制和翻译产生影响。因为在非编码区的一些序列，比如这个短的ORF和N蛋白的结合区域，在病毒感染细胞的过程中能够抑制ORFI的起始密码子编码。1．2．20RFlORFI是前导多聚蛋白，可裂解为ORFla和ORFlb两个多聚蛋白，最终可以编码15个非结构蛋白(MastersPS2006)，分别为Nspl-Nspl5。这15个非结构蛋白含有三个蛋白酶(Nsp2编码3C样蛋白酶，Nspl含有编码木瓜样蛋白酶1、木瓜样蛋白酶2和磷酸酯酶)和一个生长因子样蛋白(Nsp7)，一个RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)(Nsp9)，一个金属离子结合区域和一个解旋酶序列(Nspl0)(KocherhansRetal2001)，其他非结构蛋白的功能现在还不清楚。ORFl可以裂解为ORFla和ORFlb两个蛋白，因为在两个ORF框重叠的区域有一个七核苷酸“滑动序列”6一严一～一严一 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析(UUUAAAC)和一个假结结构(pseudoknotstructure)，这个假结结构是核糖体发生移码的信号，也是ORFlb翻译所需要的信号(EnjuanesLetal2001)。研究表明动脉炎病毒的ORFl编码的蛋白就可以启动病毒的转录，而冠状病毒的转录可能还需要N蛋白的辅助(BaricRSetal1988)。如果冠状病毒的转录需要N蛋白的参与，那么在病毒转录之前肯定通过一定的机制先把N蛋白翻译出来，而病毒如何做到这一点现在还不清楚(EnjuanesLetal2001)。1．2．3S蛋白S蛋白是PEDV的纤突蛋白，也是病毒重要的膜蛋白之一。S蛋白的大小约为180～220kD，包含有一个信号肽序列，一个跨膜区和一个短的胞内区。预测S蛋白大约有27～30个可能的糖基化位点，这些糖基化位点可能都具有重要的生物学意义(李建强等2007)。S蛋白是PEDV主要的抗原蛋白，不仅能够诱导机体产生抗体，还能诱导机体产生针对PEDV的中和抗体(BoschBJetal2003；ParkSJetal2007)。S基因内部的中和表位(COE基因，499--638aa)是诱导机体产生中和抗体的重要区域，此外，Sl蛋白中的S1D序列(636～789aa)(ChangSHetal2002)包含了一个线性抗原表位(697～742aa)和两个B细胞表位(744～759aa、756～771aa)(SunDetal2008)，这两个抗原表位都是优秀的疫苗候选抗原，被广泛用于PED疫苗的研制中。研究表明位于S基因C端的“GPRLQPY”序列也可诱导机体产生针对PEDV的中和抗体(CruzDJetal2008)。S蛋白属于I型糖蛋白，基于和其它冠状病毒S蛋白的同源性，可以将PEDV的S蛋白分为两段，S1(1-789aa)和S2(790～1383aa)(ChangSHetal2002；CruzDJetal2008；JackwoodMWetal2001)，S1是变异较大的区域，也是S蛋白的主要功能区域，S2较为保守。S蛋白内部含有PEDV与宿主细胞的受体结合位点和融合的位点，病毒通过S蛋白与宿主细胞结合后，S蛋白被水解为S1和S2两段，由此诱导蛋白构象发生变化，促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合，进而介导病毒进入宿主细胞。研究表明猪氨基肽酶N(pAPN)是PEDV的受体(LiBXetal2007)，pAPN属于II型跨膜糖蛋白，由963个氨基酸组成，主要存在于猪的小肠黏膜上皮细胞(SunDetal2012)，pAPN还很有可能是TGEV和PEDV两个病毒共同的受体(DelmasBetal1992)，而相应的PEDV与pAPN的结合区域位于S蛋白第249～529位氨基酸(孙东波等2009)。Lee报道位于S基因N端的第25～88位氨基酸也可能是病毒的受体结合位点(LeeDetal2011)。其他冠状病毒如MHV、TGEV、IBV和SARS的S蛋白也在病毒毒力和病毒进入宿主细胞的过程中发挥重要作用(WeissenhomWetal2007；KielianMandReyFA2006)。 华中农业大学2013届硕士学位论文S基因也是PEDV重要的毒力基因，不同的毒株之间的S基因的差异较大，不但有碱基的突变，还有缺失和插入，特别是强毒株和弱毒株之间，差异更大。Park等比较了DRl3亲本毒株和其弱毒株的S基因序列的差异，结果显示，亲本株与弱毒株有20个碱基的差异，试验证明致弱的毒株对仔猪的致病力下降，所以这20个碱基可能对病毒毒力有重要影响(ParkSetal2007)。日本学者将83P．5毒株通过vero细胞传到100代后发现，此时病毒对仔猪不具有致病性，通过分析S基因的序列，传100代后的83P一5与原毒株相比，有18个核苷酸突变，由此引起13个氨基酸突变，这些突变主要发生在S蛋白的信号肽序列、S1和S2的膜外区，在跨膜区和膜内区没有发现突变(SatoTetal2011)。由此可以证明S基因是PEDV的重要毒力基因。其他冠状病毒，如TGEV的S基因也是毒力相关基因(BernardSandLaudeH1995)。Femando通过反向遗传学将毒力较弱的只能定植在呼吸道中的TGEV的S基因替换为定植在肠道中的毒力较强的TGEV的S基因，发现最终获得的病毒不仅毒力增强，并且能在肠道中定植(AlmazanFetal2000)，说明TGEV的S基因不仅与病毒的毒力有关还与病毒的趋向性有关。1．2．4ORF3ORF3是PEDV的非结构基因，完整的OI强3基因共有675个碱基，编码224个氨基酸，分子量大约为25kD，预测有四个跨膜区(WangKetal2012)。所有的冠状病毒属的成员都含有这个基因，但是不同的冠状病毒在这个部位的基因不完全一样。TGEV为ORF3a和ORF3b(WoodsRD2001)，HCoV-229E为ORF4a和ORF4b(DijkmanRetal2006)，猫冠状病毒是ORF7a和7b(HerreweghAAetal1995)。目前ORF3的具体功能还不是很清楚，但是一些毒株，如DRl3疫苗毒株，由于在245～293nt有49个核苷酸的缺失，导致后面的阅读框发生变化，这些毒株的ORF3只有276个碱基，编码91个氨基酸，因此可以确定ORF3对于在体外培养的病毒是非必需的(SchwarzBetal1990；YounSetal2005)，研究表明ORF3蛋白的表达还可能降低病毒在体外的适应性(LissenbergAetal2005；WoodsRD2001)。通过反向遗传学技术研究MHV和FIPV，发现这两个病毒相同位置的辅助基因对病毒的复制也不是必需的，但是缺失这个基因后会导致病毒的毒力下降，表明这些辅助基因是病毒的毒力决定因子(HerreweghAAetal1995；deHaanCAetal2002；OrtegoJetal2003；HaiiemaBJetal2004)。研究表明TGEV和PEDV的强毒株经过细胞传代以后，毒力会减弱，这其中主要的原因可能是ORF3的变化(SongDSetal2003；WoodsRD2001)。对于PEDV，ORF3是其唯一的辅助基因，ORF3对病毒毒力有重要的影响，韩国学者Park等对PEDV的野生株和弱毒株(疫苗株)的ORF3基因序列分析发现，经过细胞适应的毒株相对于亲本毒株和野生毒株，其ORF3 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析基因有51个碱基的缺失，并且适应了细胞的PEDV的毒力也有较大的减弱。根据野生毒株和疫苗毒株ORF3的序列的差异，他们建立了一种鉴定野毒株和疫苗毒株的RT-PCR检测方法，在缺失序列的附近设计1对引物，可在野生株里扩增出245bp的片段，而在致弱株里可以扩增到194bp的片段，从而可以区分疫苗毒株和弱毒株(ParkSetal2008)。SARS病毒的ORF3基因编码的蛋白是一种跨膜蛋白，可以在宿主的细胞膜上形成离子通道，这些离子通道被称作病毒孔蛋白(viroporins)，病毒孔蛋白不仅与病毒的致病力有关，还与病毒的组装和释放有关(ZengRetal2004)。研究表明PEDV的ORF3也可以编码一种离子通道蛋白调节病毒产物释放，他们的研究显示，野毒株CV777的ORF3有4个跨膜结构域(transmembrane，TM)，跨膜结构的疏水性氨基酸可形成离子通道。致弱毒株的CV777由于ORF3中间缺失49个碱基而提前产生一个终止密码子，导致弱毒株缺乏TM3和TM4，影响了离子通道的活性，从而影响病毒的毒力，他们用siRNA干扰病毒的ORF3mRNA的合成，结果显示细胞内病毒的数量基本没有变化，也就是说ORF3不会影响病毒的复制，但是释放到细胞外的病毒显著下降，说明ORF3可以影响病毒的释放(WangKetal2012)。由于PEDV强毒株和弱毒株ORF3之间存在显著差异，因此ORF3可以作为区分临床毒株和疫苗毒株的标记，这对于PED的流行病学调查非常有用。1．2．5M蛋白PEDV的M基因长681bp，编码226个氨基酸，M蛋白属于膜糖蛋白，分子量约为27～32kD，也是病毒的囊膜表面最丰富的蛋白。M蛋白是一个三重跨膜结构的蛋白，有一个短的N端结构在胞外，在胞内有一个长的C端结构。M蛋白不仅在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用(VennemaHetal1991；deHaanCAetal1998)，也可诱导机体产生针对PEDV的中和抗体，还可诱导机体产生C【．干扰素(LaudeHetal1992)，所以M蛋白也是用于PED的血清学诊断的一个重要的候选蛋白(RenXetal2011；GuscettiFetal1998)。共表达M蛋白和E蛋白可以产生伪病毒样粒子(Virus．LikeParticles，VLP)，形成的病毒粒子前体能够具有全病毒一样诱导产生干扰素的能力(BaudouxPetal1998；HsiehPKetal2005)。不同的PEDV毒株之间的M基因很保守，所以M基因常常被用作RT-PCR技术诊断的靶基因。1．2．6E蛋臼PEDV的E基因长度为23lbp，编码76个氨基酸，E蛋白的分子质量约为8．8kD，E蛋白也是PEDV的膜蛋白，但是含量很低。E蛋白对病毒的组装和出芽是必要的，共表达M蛋白和E蛋白可以形成病毒样粒子。PEDV的E蛋白主要定位在细胞内质9 华中农业大学2013届硕士学位论文网和细胞核内，E蛋白能够通过上调IL．8和Bcl．2激活NF．r．B(XuXetal2013)。研究表明，对于缺失了E蛋白的MHV，突变M蛋白可以部分代替E蛋白的功能，同样可以形成病毒颗粒(KuoLandMastersPS2010)。E蛋白在PEDV结构蛋白中的含量最低，不同毒株之间E蛋白的变异性也很低，关于E蛋白的研究很少。1．2．7N蛋臼N蛋白是病毒的核蛋白，由1326个核苷酸组成，编码441个氨基酸，N蛋白的分子量大小在55～58kD之间。N蛋白可以结合在病毒的基因组RNA，为病毒的螺旋状核衣壳提供基本支架。N蛋白也是PEDV所有结构蛋白中含量最多的蛋白，有7个潜在的磷酸化位点。N蛋白抗原决定簇是诱导机体细胞免疫的重要组分(SaifLJ1993)，也被用于PED疫苗的研制中(葛俊伟等2009)。冠状病毒的N蛋白能够保护病毒基因组RNA在细胞内的正确结构，通过稳定病毒复制复合体来增强病毒的感染效率(LaiMandCavanaghD1997)或者增强病毒mRNAs的表达水平(TaharaSMetal1994)。N蛋白对病毒的复制没有影响，但却是病毒转录所必需的，冠状病毒的N蛋白识别并结合被称作包装序列(packagingsequence，PS)的特异性序列是冠状病毒组装病毒RNA的第一步。Hsieh在研究SARS病毒VLP的过程中发现，SARS病毒的N蛋白对病毒RNA的包装是必需的，但是对于VLP的形成不是必需的(HsiehPKetal2005)。MHV基因组RNA的组装不需要N蛋白的辅助(NarayananKetal2000)，但是N蛋白与ORFlb3’端的包装信号序列结合可以促进病毒粒子基因组RNA的组装(NarayananKetal2003)。N蛋白还具有RNA结合的能力和RNA伴侣蛋白(RNAchaperones)的活性，促进DNA和RNA的结合与模板的转化(ZunigaSetal2010)。RNAchaperones具有允许核苷酸适当折叠的功能。同一个属的病毒的RNAchaperones的序列也不一样，只有很低的相似性。MHV的N蛋白能结合在基因前的转录调节序列(transcriptionregulationsequence，TRS)“UCUAAAC"，最终会对转录产生影响。猪感染PEDV后，在早期可以产生大量抗N蛋白的抗体，并且N蛋白的保守性强，因此N蛋白可以作为早期诊断的靶蛋白(孙东波等2006；LeeHKandYeoSG2003)。研究表明，N蛋白可以存在于宿主细胞的细胞核内，推测N基因中可能存在引导蛋白到细胞核的信号序列(吕茂杰等2011)。不同PEDV毒株之间的N基因序列略有差异，强毒和弱毒之间差异较大，Lee等证实根据疫苗毒株和临床毒株的N基因不同，基于RT-PCRRFLP分析N基因可以区分PEDV临床分离株和疫苗毒株(LeeCetal2008)。 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析1．2．83’UTRPEDV的基因组为正链RNA，其复制酶是依赖RNA的RNA聚合酶，非编码区是病毒基因组复制的主要调控位点，3’非编码区是复制酶的第一结合位点。1．3PED疫苗的研究理想的PED疫苗应该符合以下几个标准：1、安全、高效；2、减少仔猪免疫后的排毒时间(主要是针对弱毒疫苗)；3、具有详细的关于黏膜免疫的数据。PEDV是肠道病毒，黏膜免疫在抵抗PEDV的感染中发挥着重要作用，黏膜免疫的主要抗体是IgA。由于猪的特殊的黏膜免疫系统，血清中针对肠道病原的抗体水平与免疫保护力并不总是一致的。血清中的抗体水平只能说明检测的猪感染了病毒，而测定初乳中的IgA的含量比测定血清的抗体滴度更能反映母猪的保护力。当母猪肠道受到PEDV刺激后，分泌IgA的免疫细胞就迁移至乳腺，在乳腺定居后向乳汁中分泌IgA抗体。这个肠．乳腺轴对研制PEDV的疫苗非常重要，也是被动免疫的基础。仔猪通过吃初乳获得IgA，这些IgA能吸附在消化道黏膜，从而让仔猪获得针对PEDV的特异性免疫。IgA是中和通过口服感染的病毒的最主要的抗体，因为与IgM和IgG相比，IgA能够有效抵抗消化道蛋白水解酶的降解。所以IgA相对于IgM和IgG来说，有更好的中和病毒的能力(SongDandParkB2012)。1．3．1灭活疫苗最先研究的PED疫苗是组织灭活苗。早在1993年，王明等就制备出猪流行性腹泻的氢氧化铝灭活苗，研究表明组织灭活苗能有效预防哺乳仔猪、母猪及成年猪的流行性腹泻(王明等1993)。但是由于组织灭活苗生产过程繁琐，质量也不易控制，所以没能够广泛使用。1994年，马思奇等又研究开发了PED的氢氧化铝细胞灭活苗，试验证明此细胞灭活苗对仔猪的主动免疫保护率和被动免疫保护率可达85％。细胞灭活苗容易大量制备，安全性好，因此在临床上被广泛应用(马思奇等1994)。由于PEDV和TGEV都是引起仔猪腹泻的重要病原，1995年，马思奇等人又研制了TGEV和PEDV二联灭活苗，该二联苗能够有效地预防TGEV和PEDV的感染，经过后海穴注射，TGEV和PEDV的主动免疫的免疫保护率分别可达100％和92％，被动免疫的免疫保护率可达87．9％和84．2％(马思奇等1995)。1．3．2弱毒疫苗1997年，日本出现了商品化PEDV弱毒(P5．V)疫苗，取得了良好的效果(KadoiKetal2002)。1999年，韩国学者通过将临床分离毒株KPEDV-9在vero细胞上传93代，得到一株致弱的KPEDV-9，通过将此弱毒株口服接种母猪和小猪能够大大提 华中农业大学2013届硕士学位论文高母猪的抗体水平和仔猪的成活率，并且没有观察到明显的临床症状，因此KPEDV-9弱毒株可以作为疫苗来预防PEDV(KweonCHetal1999)。2007年，韩国学者研究出一种新的口服弱毒PEDV疫苗．DRl3弱毒苗，这个疫苗是通过将DRl3临床分离株在vero细胞上经过传100代后致弱的，试验证明此弱毒疫苗对猪具有很高的保护率，并且在猪体内经过三代的传代，毒力也没有增强。他们的实验表明弱毒疫苗通过口服比肌注效果更好，因为口服疫苗后的仔猪的死亡率相对于肌注的要低，并且抗体水平要高的多(SongDSetal2007)。在中国，佟有恩等人通过将CV777毒株在Vero细胞上传代125代后，获得了CV777弱毒株，临床试验表明，弱毒株的毒力显著下降，接种仔猪后，仔猪能够有效地抵抗强毒感染，并且该弱毒株在猪体内传了6代，也没有见到毒力的返强，区域性的临床试验表明此毒株的免疫原性和安全性都很好(佟有恩等1998)。1999年，佟有恩等在以前的工作基础上，又研发出了TGEV和PEDV的二联弱毒苗，经过临床试验，二联弱毒苗的主动免疫和被动免疫的免疫保护率分别为97．7％和98％，高于二联灭活疫苗的免疫保护率，免疫剂量也比灭活疫苗低，显示了弱毒疫苗的优势(佟有恩等1999)弱毒苗也有缺点，免疫后不是所有的猪都能产生稳定的免疫力。使用弱毒苗后，能让没有病毒的猪场由于免疫而存在PEDV，弱毒疫苗还有毒力返强的危险。1．3．3基因工程疫苗基因工程疫苗是一种新型疫苗，一般都是作为口服疫苗使用。基因工程疫苗是将具有免疫原性的病毒或细菌蛋白，通过载体转入宿主(致弱的细菌、病毒或有益微生物)内，借助宿主表达出需要的目的蛋白，然后直接将能表达目的蛋白的宿主接种动物，基因工程疫苗不但更加接近自然感染，还可以达到一次免疫防控多种疾病的目的，乳酸杆菌等有益宿主菌接种后还可以增加机体的免疫力。徐丽丽等将PEDVS蛋白的SD和COE两段序列，克隆到载体并转化到致弱的鼠伤寒沙门氏菌内，成功表达出这两个蛋白，小鼠实验表明，重组菌能够诱导小鼠产生体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫(徐丽丽2011)。葛俊伟等分别构建了表达PEDVCOE和Sl蛋白的重组干酪乳杆菌，试验表明重组菌能够诱导小鼠产生分泌型IgA(slgA)和高水平的特异性IgG，不但能够诱导黏膜免疫应答，还能够诱导产生细胞免疫和体液免疫应答(葛俊伟等2010；葛俊伟等2009)。1．3．4核酸疫苗孟凡丹通过构建表达PEDVS(S和S1段)蛋白的真核载体，确定重组蛋白可以在BHK-21细胞中表达后，将此重组真核载体注射入小鼠体内。结果表明，此核酸疫苗不但可以增加小鼠T细胞的增殖能力，增加脾脏和外周血中CD4十T、CD8十12 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析T细胞的数量，还能够诱导机体产生高水平的IFN吖和针对PEDV的特异性抗体和中和抗体(孟凡丹2011)。核酸疫苗属于新型疫苗，是未来疫苗发展的一个方向。1．3．5转基因植物疫苗2003年，Bae等将PEDVS蛋白上的中和表位区域COE基因转入到烟草，并在烟草中成功表达。试验表明，此转基因疫苗能有效地诱导宿主的体液免疫和黏膜免疫应答，但是表达量很低(Bae儿etal2003)。2005年，Kang将PEDV的COE序列插入到烟草基因组，并成功表达，表达量占可溶性蛋白总量的0．1％，表达量比以前大大提高。转基因植物作为口服疫苗能产生理想的黏膜免疫反应，并且能够大量生产，是未来疫苗发展的一个新的方向(KangTJetal2005)。1．4冠状病毒感染性克隆研究进展病毒的感染性克隆属于反向遗传学研究范畴，是研究RNA病毒致病机理、病毒与宿主的相互作用机制以及基因的功能最有力的工具。相对于经典的遗传学从表型到遗传物质来研究生命的发生、发展规律；反向遗传学是通过遗传物质(RNA或DNA)到表型来阐述生命的本质，与反向遗传学相关的各种生物学实验技术统称为反向遗传学技术。由于正链RNA病毒的复制过程不经历DNA阶段，现在的分子生物学技术又不能在体外直接对RNA进行改造，严重阻碍了RNA病毒的研究。感染性克隆为研究RNA病毒提供了一个很好的工具。感染性克隆是通过对病毒RNA序列进行分析，首先获得RNA病毒基因组的全长eDNA，把eDNA置于合适的启动子下游，如真核启动子CMV和原核启动子T7，在体内或体外的环境下，转录出具有感染性的RNA，这样就可以通过对克隆的eDNA进行改造，间接达到改造RNA的目的，这个过程最终是获得具有感染活性的RNA，因此被称为感染性克隆。科学家获得的第一个感染性克隆的RNA病毒是QD噬菌体(TaniguehiTetal1978)，到目前为止人们已经获得了很多RNA病毒的感染性克隆，如丙型肝炎病毒(W凼taTetal2005)、日本乙型脑炎病毒(YunSIetal2003)、口蹄疫病毒(ZibertAetal1990)和猪呼吸与繁殖综合征病毒(TruongHMetal2004；LeeCetal2005)、马动脉炎病毒(MolenkampRetal2000)等。病毒感染性克隆的关键步骤是获得真实的全长eDNA。冠状病毒感染性克隆的难点在于：1、很难获得真实的全长eDNA，冠状病毒是基因组最大的RNA病毒，基因组长达30kb，虽然据报道现在的RT-PCR技术可以一次性的获得长达20kb的片段(ThielVetal1997)，但是对于冠状病毒来说，由于基因组太大，所以全长eDNA的克隆都是先通过RT-PCR获得若干个覆盖基因组全长的片段，然后将各个片段连 华中农业大学2013届硕士学位论文接获得全长cDNA；2、很难找到合适的载体来承载如此大的片段，细菌人工染色体(BAC)和痘病毒载体能够容纳超过150kb的外源片段，并且便于操作，因此被广泛用作冠状病毒感染性克隆的载体(111ielVetal2001；CasaisRetal2001；mlrllazanFetal2000)；3、eDNA在宿主菌内不稳定，很多实验室在构建eDNA克隆的过程中都遇到大片段的缺失、重排或突变(RiceCMetal1989；SumiyoshiHetal1992)，这个原因目前还不是十分清楚，可能是在病毒基因组的57端序列存在有潜在的启动子，转化到细菌后，翻译的病毒蛋白对细菌的生长有破坏作用，通过改变宿主菌株、更换载体(SriburiRetal2001；ZhangFetal2001)、降低培养温度(黄莺等2003；LaiCJetal199I)、将毒性片段分段克隆、通过体外连接的方式或者在毒性基因的内部插入一个内含子(GonzalezJMetal2002)等可以解决eDNA在宿主内的稳定性问题；4、转录产物的感染性，感染性克隆的最终目的是获得具有感染性的RNA，有时即使获得了真实的eDNA，很多因素还会影响eDNA的转录，如5’端帽子结构、转录的方式(体内转录和体外转录)、关键位点碱基的缺失或突变以及3’端的序列(如polyA)(赵卓2004)；5、对于冠状病毒来说，要获得具有感染性的RNA，还需要N蛋白的辅助(BaricRSetal1988)，PRRS病毒的感染性克隆的构建过程中也有相似的报道(LeeCetal2005)。用于做感染性克隆的病毒毒株必须是适应细胞的毒株，而不能使用直接从临床上分离的毒株，可能是因为野毒株对细胞的毒性太大，不易在细胞上培养。很多冠状病毒属成员的感染性克隆都已经被人们所构建，如TGEV(AlmazanFetal2000)、MHV(YountBetal2002)、IBV(CasaisRetal2001)、HCoV-229E(ThielVetal2001)、SARS(YountBetal2003)。到目前为止，PEDV的感染性克隆还未见报道。14 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析2．研究目的与意义2010年以来，PED在我国大规模流行，给养猪业造成了巨大的经济损失，即使接种了PED弱毒疫苗或灭活疫苗的猪场也不能幸免。本试验对我国目前猪场使用的PED弱毒疫苗进行全序列的测定，分析疫苗毒株与流行毒株和其他参考毒株的遗传进化关系，并分析疫苗毒株与流行毒株之间的核苷酸和氨基酸序列差异，从基因水平上分析猪场疫苗免疫失败的原因，为PED的预防和新的疫苗的开发提供理论依据。感染性克隆是研究RNA病毒基因的功能、致病机理、病毒与宿主的相互作用的重要工具，本试验尝试以PED疫苗毒株为基础构建PEDV全长eDNA，为PEDV的感染性克隆的构建打下基础。 华中农业大学2013届硕士学位论文3．材料与方法3．1材料3．1．1PEDV毒株、菌种和质粒PED疫苗毒株来自三个不同省份的猪场用的弱毒活疫苗，大肠杆菌DH5a感受态细胞由本实验室保存，大肠杆菌DHl0B感受态细胞购自博迈得生物公司，感受态细胞Topl0购自北京全式金生物技术有限公司，pGEX—KG载体、pcDNA3．1(+)载体由本实验室保存，pBeloBACll载体由本实验室孙明老师惠赠。3．1．2主要试剂TSA和TSB培养基购自R&D公司；胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司；质粒小量提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自BioFlux公司；RNA反转录试剂盒、pMD．18T载体试剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶、LADNA聚合酶、dNTP、PremixTaqversion2．0等购自大连TAKARA公司；RNA反转录试剂盒、Trizol试剂等购自Roche公司；各种无机化学试剂(氯化钠、氯化钾、EDTA等)和有机化学试剂(无水乙醇、冰醋酸等)购自国药集团化学制药有限公司。3．1．3主要仪器设备PCR仪由美国BIO—RAD公司制造；水平摇床由北京市六一仪器厂生产；全温振荡培养箱购自江苏太仓市仪器设备厂；恒温水浴锅由富华仪器有限公司制造，超净工作台由北京东联哈尔仪器有限公司制造；常温或冷冻离心机由德国Eppendorf公司制造；．80℃超低温冰箱由中科美菱公司制造；生化培养箱由哈尔滨东联电子技术开发有限公司制造；琼脂糖凝胶电泳仪由北京六一仪器厂制造。3．1．4缓冲液及培养基3．1．4．1缓冲液0．1mol／LCaCl2溶液：称1．11gCaCl2粉末溶于ddH20中，定容到100mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，常温保存。50xTAE溶液(pH8．5)：取242gTrisbase，37．2gNa2EDTA·H20溶于约800mL去离子水中，充分溶解后加入57．1mL冰醋酸，定容到1000mL。3．1．4．2培养基LB液体培养基：取胰蛋白胨10．0g，酵母提取物5．0g，NaCI10．0g，溶于去离子水后定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存。16 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析TSA固体培养基：取40gTSA粉末加入到1000mL去离子水中，121。C高压蒸汽灭菌15min。TSB液体培养基：取30gTSB粉末加入到1000mL去离子水中，121℃高压蒸汽灭菌15min。3．1．5本试验用的引物根据GenBank中公布的PEDV参考毒株CV777全基因序列(AF353511)，设计扩增M基因、N基因所需要的引物，设计12对覆盖PEDV全基因组的引物扩增疫苗毒株全长cDNA，各个片段之间都有60～100bp的重合，以保证所获得cDNA的真实性，设计融合引物扩增获得感染性克隆体外转录和体内转录所需要的5’端和3’端，所有引物由上海生工或南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物信息见表3．1。表3-1本试验用到的引物Table3-1primersusedinthisstudy引物名称引物序列引物的位置备注P1FP1RG1TGCGGCCGC2煳尉CGZC础C勿Z4GGGACrrAAAAAGA：rrn℃1’ATGGAAGCTTCATGGTGTrCAAGGAACT1～19129l～13081-1308；1308bp加T7promter(下划线)P2下FCCCACAGTGTC￡幽鲤GCTTGAAGAGAT2423-2452P2下RGGCTGCAGT从GAGCAACACCTGAGT4489^45062423-4506；2084bp上游加nfI位点P4FP4RGCGAAGCllAGCTCGTGCCTrnrGATGTGGCTGCAGACCTCGCATAGTrGCACT675M7756757～9536：2780b／lp9519～!n--,9536’rP6上FGCGAAGCTTCCGAGTATACTATGATGGAT12936-1295512936-14790；1855bpP7FP7RGCCAAGCTTGGTGCACGTATTGTGTGAACTGCAGATGCGGCCGATCTrAl’TAA1AACAGCCTCAT16280~1629518066~1809616280~18096；1817bpP9FP9RGGCAAGCTTGCCAAGCGTf诅GGTAGGACTCGGCTGCAGllIGAATAGGCAGllACGAC黑美篇18893～21074；2182bp薯麟l曩黼舞瓣瓣藤篓熏蹇翼熏羹麓蠹穗鬃粪荔瓣慧P10上FTACCCTTAC鱼丝旦鲫AGCATTPIO下RCGCTGCAGCTATTGGGCAGAGAAGCT22616-2263822616-24413；1797bp24396-24413上游加EcoRI位点17 华中农业大学2013届硕士学位论文本试验用到的引物濮黝二亟砸二二耍耍夏型曼!塑笪笪量鱼鎏PllFGGCAAGCT，兀ACCAGATGTAATCCCAGAT24341～2436024341～27256；C刖FCMVRPEDV5’FPEDV5，R篙GT器TG鬻CG篱GC装CG篇CG篙TT爱GAPCATTGATGTTAGTTAGGAcC代Tp来cD自NA3．，㈩融合获得含有CCGTAGATAGAAAATCTrr]r1=AAGTGAGCTC，’、“，，，，、TGCrrA胁GACCTCCC⋯、7融合获得笛有GGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCACTTAACMV启动子的AAAGATTTTCTATCTACGG5’端GGAAGCTTCATGGTGTTCAAGGAACTPEDMRGCCAAGCTTTlAGACT从ATGAAGCACPEDV的鉴定3．2试验方法3．2．1PEDV疫苗毒株的鉴定试验从广东、广西和湖北省的3个猪场获得了3株PED冻干弱毒疫苗，首先用RT-PCR扩增M基因，并对M基因进行测序，鉴定疫苗中是否含有PEDV及3株疫苗毒株的同源性。3．2．1．1提取PEDV的总RNA参照BioFlux公司SimplyP总RNA提取试剂盒说明书1)将疫苗用DMEM培养基稀释，取200IxL到1．5mL离心管中；2)加入SolutionR2600pL，充分颠倒混匀，室温静置5min；3)将上清液吸入到Spincolumn中，套上收集管，4"C，12000r／min，离心30s；弃去收集管内的液体；4)向Spincolumn中加入600pL，WashBuffer，4℃，12000r／min，离心30s，弃去收集管内的液体；5)重复步骤4；6)将Spincolumn重新放入收集管内，4"C，10000r／min，离心lmin；18 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析7)将Spincolumn转移到一个新的不含RNA酶的1．5mL离心管中，在膜的中央加入25laLDEPC水，室温静置1min，4"C，12000r／min，离心30S，离心管中就是获得的总RNA。3⋯212合成eDNA按照大连宝生物公司反转录试剂盒说明书进行：反转录的体系为20pL：RNA161．tL，5×PfimeScfipt癣RTMasterMix4此，混匀后，按照下面的反应条件进行反应：37"C，15min；85℃，5S；4"C保存。取出eDNA样品，可直接用于下游反应，也可放于．20℃保存。3⋯213PCR鉴定PCR反应体系为50皿，其中rTaqlI．tL，10×PCRBuffer5pL，dNTP4“L，上下游引物(10mM)各lI．tL，cDNA模板3pL，加ddH20至50“L，混匀。反应在如下条件下进行：首先94。C预变性5min；然后按94℃变性45S，50℃退火45S，72"C延伸45S，反应30个循环；72℃，延伸10min；4"C保存。同时设阴阳性对照，阳性对照加阳性的cDNA模板，阴性对照以ddH20代替模板，其它条件相同。反应完成后，取5pL产物及阴阳性对照产物加1pL6xLoadingBuffer在l％的琼脂糖凝胶电泳检测，电压160V，电流250mA，电泳完成后将琼脂糖凝胶放在EB中染色10min，在凝胶成像系统观察结果。3⋯214DNA纯化参照BioFlux公司DNA快速回收试剂盒说明书：1)将要回收的DNA片段(PCR、酶切产物等)经1％的琼脂糖凝胶电泳；2)电泳结束后将琼脂糖凝胶放入EB染色5～10min，在长波紫外灯下，用锋利的刀片快速将含目的基因的琼脂凝胶块切下来(尽量完全把目的基因全部切出，DNA在紫外灯下容易突变，切胶时要迅速)，放入一个洁净的2mL离心管中；3)称量切下的凝胶的重量，按1：3的比例(凝胶质量mg：溶胶液体积I_tL)2NAExtractionBuffer：4)将离心管放入50℃恒温水浴锅10min，在此过程中，每隔3rain上下颠倒几次离心管，以加速融化，直到凝胶块完全融化；5)将融化后的混合液转移至吸附柱内，6000g／min，离心lmin，弃去收集管内的液体；6)加500“LExtractionBuffer到吸附柱内，12000g／min，离心lmin，弃去收集管内液体；19 华中农业大学2013届硕士学位论文7)向吸附柱内加750gLWashBuffer，室温静置5min，12000g／min，离心1min，弃去收集管内液体；8)再次于12000g／min，离心2min，然后将吸附柱转移到无菌1．5mL离心管中，打开盖子，37。C静置5min，除去残留的洗脱液；9)向离心柱内加30～50pL去离子水，于37"C温育5min；10)10000g／min，离心1min，为增加洗脱效率，可将洗脱后的液体再次加入到吸附柱，静置后离心。离心后的离心管内的液体即为目的基因片段，可直接用于下游试验，也可先放在．20℃保存。3．2．1．5PCR纯化产物的连接将纯化的M基因片段与pMD．18T连接。反应体系10pL，其中SolutionI5pL，目的片段4．3“L，T载体0．7gL。16。C过夜连接。3⋯216大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)1)从．80。C冰箱取出E．coliDH5a菌种，在不含任何抗性的TSA固体培养基上划线培养，直到长出菌落(DH5a需要10～12h)；2)挑取一个E．coliDH5a单菌落，接种到5mlLB液体培养基中，37。C，180r／min，过夜培养，直到菌液饱和；3)将过夜培养的饱和菌液按1：100转接到100mL的LB液体培养基中，37。C，180r／min，震荡培养，直到细菌生长至对数期(此时细菌的活力最强)，一般需要2～3h，在无菌条件下将菌液转移至预冷的50mL的离心管中，冰上静置30min；4)4。C，5000r／min，离心10min，弃上清，彻底除去残留培养基；5)向离心管内加入10mL预冷的O．1mol／LCaCl2，重悬沉淀，冰上放置30min，4℃，5000r／min，离心10min，弃上清；6)再用2mL预冷的O．1mol／LCaCl2重悬，即为所需要的感受态细胞，可立即用于转化，或者加入终浓度为150／o～20％无菌的甘油，100pL／管分装到无菌的1．5mLEP管中，放在．80"C冰箱保存备用。3⋯217连接产物的转化1)从．80。C冰箱取出DHSa感受态细胞，放置在冰上融化，将重组质粒加入到感受态细胞中，轻弹管壁混匀(不能剧烈吹打)，冰上放置30min；2)将离心管放在42"C水浴锅中90S，然后快速取出放置于冰上，冷却2min(此过程千万不能晃动离心管)；20 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析3)向离心管中加500gLLB培养基，37"C恒温摇床，180r／min，震荡培养45min(此过程为了让菌体复苏，使质粒上的相关抗性基因表达)；4)将摇好的菌液于5000r／min，离心5mini在超净工作台中，弃去多余的上清，留下100gL，重悬菌体，用移液器将菌液加入到含100I上g／mLAmp的TSB培养基平板上，用事先准备好的无菌的涂布器将菌液涂匀。先将平板正面朝上放在37℃培养箱，等平板上的液体完全吸收后，将平板倒置，37"C培养10-14h。3．2．1．8挑取重组菌单菌落在超净工作台中，用10uL枪头蘸取单个菌落放入LB培养基(含终浓度为100gg／mLAmp)的细菌瓶中，37"C恒温摇床，180r／min，震荡培养8h至菌液饱和。提取质粒进行酶切和PCR鉴定。3⋯219提取重组质粒参照全式金公司质粒小量提取试剂盒说明书：1)取3mL培养6～8h的菌液，加入到1．5mL的EP管中(分两次加入)，100009／min，离心lmin，尽量弃去上清；2)加入250gL含RNaseA的RB溶液，在涡旋仪上震荡悬浮细菌沉淀：3)加入250gL裂解液LB，轻轻的上下翻转EP管，混合数次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液(时间不能超过5min)；4)加入黄色溶液NB，轻轻上下颠倒混匀数次，看到溶液颜色由蓝色完全变成黄色，说明中和完全，直到形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min；5)12000g／min，离心10min，将上清加入到吸附柱中；6)12000g／min，离心1min，弃去收集管中的液体；7)向吸附柱中加入650gLWB，12000g／min，离心lmin，弃去收集管中液体；将吸附柱放回收集管，再次于12000g／min，离心2min，彻底去除残留的WB。8)将吸附柱放入一个干净的离心管中，打开盖子，37"C放置5min；9)在柱的中央加入40“L离子水，60～70℃水浴预热1min；10)10000edmin，离心1min，洗脱质粒DNA，洗脱出的质粒DNA可直接用于下游试验或者于．20℃保存备用。3．2．1．11)重组质粒的鉴定3⋯2111)．1琼脂糖凝胶电泳鉴定取提取好的质粒5pL，加l“L6xloadingbuffer，以15000DNAMarker作对照，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，EB染色后，用凝胶成像系统观察结果。 华中农业大学2013届硕士学位论文3．2．1．10．2PCR鉴定PCR反应在25pL体系中进行，各组分别为Premixtaq12．5“L，质粒模板1肛L，M基因的上下游引物各1“L，加ddH20至25“L，同时做阴阳性对照。反应条件同上。反应结束后取10“L样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，EB染色后观察结果。3．2．1．10．3重组质粒的酶切鉴定PCR阳性的重组质粒，进行双酶切，酶切反应体系为20¨L：双酶切：BamHI11．tL，HindlIllbtL，10×Kbuffer2pL，质粒模板10肛L，加ddH20至20pL；37。C，酶切2h。反应完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定、染色、观察。3．2．1．11M基因重组质粒测序经过鉴定正确的重组质粒选2个送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序。3．2．2PEDV疫苗株全长cDNA的克隆选其中一个疫苗毒株，根据基因组内部的酶切位点设计覆盖全基因组的12对引物来扩增疫苗毒株全长cDNA(连接方案见图3—1)。酶切位占EcoRISPhlMIulBlnlSnaBIStulEcoR521SnaBlAPaIClalEcoRI图3-1PEDV全长cDNA构建方案Fig．3-1ThemethodsfortheconstructionofthePEDVfull-lengthcDNA 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析3．2．2．11病毒砌叮A提取取200gL稀释的弱毒疫苗加入到不含RNA酶的1．5mL离心管中，加入lmLTrizol，剧烈振荡后，室温静置5min；加200gL氯仿，剧烈振荡，冰上静置7min，4。C，12000r／min，离心10min；取上清到另一个干净的不含RNA酶的离心管中，加入500gL异丙醇，混匀，冰上静置10min，4"C，12000r／min，离心7min；弃上清，加800pL75％的预冷的无水乙醇；8000r／min，离心5min，弃上清，自然干燥，加25gLDEPC水溶解沉淀，即为所提取RNA模板。3．2．2．2eDNA合成操作过程按照Roche公司RNA反转试剂盒说明书进行：在PCR管中加入RNA模板11gL，Randomprimer2gL，混匀后，在PCR仪中65℃加热10min(破坏RNA的二级结构)，然后迅速放在冰上。冷却后加入4“L5×Buffer、O．5gLRNA酶抑制剂、2gLdNTP和O．5pL反转录酶。按下面条件进行反应，25℃，10min；50℃，60min；85℃，5min，反应完成后迅速放于冰上，即获得所需要的cNDA，eDNA可以立即使用也可放在．20"C备用。3．2．2．3全长eDNA各个片段的扩增所有的都反应在50¨L反应体系中进行：eDNA模板3uL；上、下游引物各2¨L，dNTP8gL，10xLAPCRBuffer5gL，LATaqO．5灿，加ddH2050此。反应条件：94。C预变性5min；然后94。C变性45S，50～58℃退火(不同片段需要的退火温度不一样)45S，根据片段的大小72℃延伸1~4min，30个循环；72。C延伸10min，最后4。C保存。反应结束后，取5¨L产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，染色后观察结果。PCR阳性的模板，经纯化回收后与pMD．18T载体进行连接，经过转化，挑取阳性克隆，鉴定正确后选取3个阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。3．2．2．4体外转录5，端和3，端的克隆试验计划采用体外和体内两种转录系统对全长eDNA转录，以获得具有感染性的RNA。体外转录是在T7启动子的作用下，在试管中加入RNA聚合酶、rNTP、甲基化的帽子结构在合适的缓冲液中转录以获得具有感染性的RNA，然后再感染细胞，属于RNAlaunched，因此需要得到含有原核启动子的5’端，以及转录终止信号的3’端，本试验使用T7启动子，以polyA尾巴作为转录终止信号，可以保证转录获得真实的RNA。T7启动子和polyA都是提前合成在引物上，通过PCR扩增将T7启动子和polyA与PEDV5’端和3’端融合在一起，经过纯化、转化、鉴定、测序，选取测序正确的作为5’端和3’端。从而获得所需要的T7—5’端和3’-polyA端。PEDV 华中农业大学2013届硕士学位论文3’端的eDNA模板按照以下条件转录获得：在PCR管中加入12laLRNA模板，1“Loligo(dT)18，在PCR仪中，65。CjJI热10min，取出后迅速放在冰上冷却，然后再加入4laL5xBuffer、O．5laLRNA酶抑制剂、2laLdNTP和O．5此反转录酶。按下面条件进行反应：55℃，30min；85℃，5min。反应完成后将PCR管迅速放于冰上，即获得所需要的eNDA，eDNA可以立即使用也可放在．20。C备用。3．2．2．5体内转录5，端和3，端的克隆体内转录是在细胞内转录，属于DNAlaunched，即将插入全长cDNA的重组质粒转染到vero细胞内，借助细胞的转录系统转录出具有感染性的I矾A；体内转录需要体内转录所需要的真核启动子和终止信号，本试验用CMV作为体内转录的启动子，polyA+HDV核酶+BGH+多聚核苷酸作为转录终止信号。3．2．2．5．1CMV-PEDV5’端的获得采用融合PCR方法将CMV启动子与PEDV5’端融合在一起。以上述获得的cDNA为模板，50laLPCR扩增体系：cDNA模板3“L，dNTP4pL，5xprimeSTARbuffer10uL，上下游引物各2¨L，PrimeSTARDNA聚合酶O．5肛L，加水至50¨L。反应按以下条件：首先95"C预变性5min；然后98。C变性10S，退火55℃‘15S，72。C延伸90S，30个循环；72。C延伸10min；4"C保存。首先扩增出含有融合片段的PEDV5’端。再以pcDNA3．1(+)为模板，用CMV的引物获得含有融合片段的CMV启动子。经过PCR鉴定正确后，把两个片段回收纯化。再以纯化的CMV启动子和PEDV5’为模板，分别用CMV的上游引物和PEDV5’的下游引物进行PCR反应将两个片段融合在一起。反应在50¨L体系中进行：两个回收的片段各2pL，上、下游引物各2¨L，dNTP4laL，5xprimeSTARbuffer10pL，PrimeSTARDNA聚合酶O．5此，加水到50此。混匀后在PCR仪中扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后用胶回收试剂盒回收，与T载体连接、转化，鉴定，测序。从而获得正确的可以进行真核转录的含有真核启动子的CMV-PEDV5’端。3．2．2．5．2PEDV3'-polyA-HDV-BGH的获得BGH用pcDNA3．1(+)为模板扩增，polyA和HDV设计在引物上。以oligo(dT)18作为引物转录获得的cDNA为模板，首先扩增PEDV3’端。再以pcDNA3．1(+)为模板扩增获得BGH和多聚腺苷酸终止信号，然后将两个片段通过融合PCR的方法融合在一起(方法与CMV-5’端的获得相似)，经过片段回收纯化、与T载体连接、转化、鉴定、测序。从而获得正确的真核转录终止序列PEDV3’-polyA．HDV核酶．BGH．多聚核苷酸。24 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析3．2．3PEDVN基因的克隆以弱毒疫苗毒株为模板，扩增PEDVN基因，扩增后经过琼脂糖凝胶回收纯化，用BamHI和Hind111分别对目的基因和pcDNA3．1(+)载体进行双酶切，酶切后用琼脂糖凝胶电泳回收纯化DNA，用T4DNA连接酶进行连接。连接反应在20此体系中进行：T4DNA连接酶1gL，10xT4Buffer2gL，目的基因14“L，载体3laL；16-22℃过夜连接。连接产物转化到E．coliDH5a感受态细胞，涂布平板、挑菌、提取质粒、鉴定、测序。方法同M基因的克隆。3．2．4疫苗毒株全基因组、S、ORF3、M、N基因的序列分析比较用DNAstar将克隆得到的疫苗毒株的所有片段拼接在一起，从而确定了疫苗毒株完整的基因组序列信息。分析疫苗毒株的分子特征，并将疫苗毒株与NCBI上已公布的16株PEDV毒株进行比较；用Megalign分析不同毒株的核苷酸同源性，分析疫苗毒株与流行毒株的基因序列之间的差异；并利用MEGA5．0分析PEDV疫苗毒株与2010年以前的毒株和目前的流行毒株之间的遗传进化关系。表3．2是进行全序列比较所用的PEDV毒株的序列信息。试验还分别分析了疫苗毒株的S、ORF3、M、N基因与流行毒株(选取全国不同省份在2010-2012年的毒株)和参考毒株的核苷酸和氨基酸同源性及序列差异，并分析这四个基因与流行毒株和其他参考毒株的遗传进化关系。表3．3、3．4、3．5、3-6分别是疫苗毒株的S基因、ORF3基因、M基因、N基因分析所用到的毒株的序列信息。表3-2PEDV疫苗毒株与其他毒株的序列信息Table3-2PEDVstrainsforsequenceangnmentandphylogeneticanalysis 华中农业大学2013届硕士学位论文一一．二—二__二—————————————————————————————————————————————————一表3-3PEDV疫苗毒株与其他毒株的S基因序列信息Table3-3PEDVSgeneforsequencealignmentandphylogeneticanalysis毒株名称翼茎呈鲞塑量堡鱼整兰墨兰鲞塑—蕊————————磊r——————一一JQ282909福建，2011VaineKCl89944CH／FJND-3／201120∞疫苗伯建，Brl／87Z25483英国，1987CH22-JSJQ979290江苏，2011C”77AF353511比利时，1993CHl3-GXJQ979288广西，2011JS-2004-2AY653204中国，2004CHl8-HainanJQ979291海南，201LJB／03DQ985739黑龙江，2006HB-2011-4JX435301河北，2011LZCEFl85992中国，2006HUI-2012JX512907黑龙江，2012DXEU031893甘肃，2007CH／GXNN／2012JX018179广西，2012DRl3ParJQ023161韩国，2007HENl2-2012KC242898洞南，2012DRl3AttJQ023162韩国JX4-2012KC242907江西，2012831'-5AB548618日本AH2-2012KC242901安徽，2012MKAB548624日本ZJl7-2012KC242903浙江，2012CH／SDQD／2011JQ638919山东，2011SD-MJX560761山东，2012CH／XCYL／llJX501323河南，2011FQ／FJ／2012．1X258672福建，2012CHGD．01JN980698广东，2011GD-AJXl12709广东，2012HuNJQ517274湖南，2011HB-2012-2，JX435303河北，2012ZJ-2011-2JN825711浙江，2011BJ-2012-2，JX435300北京，2012CHl7-GZ!里!!!!!!重型：!!!!竺!坚望竺鬯兰竺竺!!!圣!．!!!!!墨塑：!!!!_----_____-_--_____——____————____-___--_----———————●———___l__-__l__-_-——————————————————一一表3-4PEDV疫苗毒株与其他参考毒株的ORF3基因序列信息Table3-4PEDVORF3forsequencealignmentandphylogeneticanalysisCH／SJN547228中国，1986BJ-2011—1JN825712北京，2011Brl／87Z24733英国，1987CH／PDSBF／llJN547396洞南，201CV777AF353511比利时，1993SC110816JX878383四川，2011CV777vacGU372744CV777疫苗株CH／JLCC／2011JQ664302吉林，2011LZCEFl85992中国，2006Atl2011KCl61186安徽，2011CH／SHH／06GU372740上海，2006CH／GXWP／2011JQ664298广西，201CH／HIJM／07GU372735黑龙江，2007C蛐Ⅱ唧-2／2011JQ305099黑龙江，2011CH／GSJIH／07GU372743甘肃，2007FJ／PT／llJQ678040福建，201CH／GSJII／07GU372742甘肃，2007CH／SH／2011JQ664299上海，2011CH／JL／08GU372734吉林，2008ZJ120101JX880080浙江，2012JSSEl2008KCl61195江苏，2008P229KCl20799福建，2012CH／JL／09GU372741吉林，2009CH／TJ-2012KCl48525天津，2012Chinju99EU792474韩国，1999CH／TY／12JX501332江西，2012DRl3EU054929韩国，2007GD—BJX088695广东，2012DRl3AttJQ023162韩国AHQJ2012KCl61188安徽，2012CH／HBQX／10JN547395河北，2010JSTS2012KCl61198江苏，2012CH／SDQD／2011JQ塑1211些丕：三Q!!笪型竖iQ!Z箜塞丝：垫!三一26 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析表3．5PEDV疫苗毒株与其他参考毒株的M基因序列信息Table3-5PEDVMgeneforsequenceaHgnmentandphylogeneficanalysis表3_6PEDV疫苗毒株与其他参考毒株的N基因序列信息Table3-6PEDVNgeneforsequencealignmentandphylogeneticanalysis毒株名称登录号来源毒株名称登录号来源Vaccine．KCl89944疫苗BJ2010JF690780北京，2010CV777CH，SLZCLJ】啪3JS-2004-2C日n玎屺H帕6C丑mLJ】臣，06C日蔼髓，06C日刀^佃V06CH，J．sX，06CHⅢLJ】Ⅵ707HL皿YDRl3att831．-5HB／HSAF35351lⅢ547228EFl85992DQ072726感653206FJ473388FJ473390FJ473392FJ473387FJ473389FJ473393GU321197JQ023161JQ023162AB618622JF700126比利时，1993中国，1986中国，2006黑龙江，2003江苏，2004湖南，2006黑龙江，2006上海，2006内蒙，2006江苏，2006黑龙江，2007黑龙江，2008韩国，2007韩国日本河北，2010CH／HLJQ／2010C日阮U咂【Z，2011C丑ySDIU●1／2011CH／丑【L肛Ⅱ【／20nCH删ZZ／2011C日^∞囵ⅣM／12011BJ-2011—1HB|GYHuNCHGD-01FJND-2011-3GD．ASC’I．A12-3JNl2-3WSl2．2HQ455345JQ743655Ⅲ601060JQ743651JN601052JQ743656小825712JQ934948Ⅲ243758J)(261936JQ282909JXl12709Kc243782JX406142JX406138JX406143黑龙江，2010浙江，201l山东，20ll黑龙江，2011河南，2011广西，201l北京，2011河北，201l湖南，2011广东，2011福建，2011广东，2012四JII，2012山东，201227 华中农业大学2013届硕士学位论文4．结果及分析4．1PEDV疫苗毒株的鉴定试验首先鉴定三株弱毒疫苗中是否含有PEDV毒株(图4．1)，然后克隆三株疫苗的M基因(图4．2)并分析三株疫苗毒株M基因的序列(图-3)。2000bp1000bp750bp500bp图4-1弱毒活疫苗中PEDV的鉴定Fig．4-1IdentificationofthePEDVintheattenuatedlivevaccineM：DLllM2000Marker；1：疫苗一M基因的PCR扩增；2：疫苗二M基因的PCR扩增；3：疫苗三M基因的PCR扩增；4：阳性对照；5：阴性对照PCR结果显示(图4．1)，三个疫苗中均扩增出PEDV的M基因，大小为681bp，说明三株疫苗均含有PEDV。4．2pMD．18T-M重组质粒鉴定图4-2重组质粒的PCR鉴定(A)和酶切鉴定(B)F酶牝IdentificationofplasmidbyPCR(A)andrestrictionenzymedigestion(B)(A)M：DLlM2000Marker：1~2：疫苗一的PCR扩增；3~4：疫苗二的PCR扩增；5~6：疫苗三的PCR扩增：7：阳性对照；8：阴性对照(B)M：DLⅣ2000Marker；l~2：疫苗一的酶切鉴定：3~4：疫苗二的酶切鉴定；5~6：疫苗三的酶切鉴定2R 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析垅I嘶舱1垤啪2w．ee／ne3vaccine1Ⅵ砬cine2Ⅵ蛤睛艳3vacci旧1vaccine2珑l嘲3垤洳1vaccine2垅帕cir挎3vaccine1坭吣cil’e2wI洳3vtlccir旧1vatxine2v越clrIe3vaccine1vaccine2辘l洳3vaccine1删ne2v贰埔怆3镩。cinel％Io嘲e2vaccine3蝴ccinel垤湘2垤lccIne3垅I咖'v．aecine2vaecille3vaccine1城I洳2vaccine3{'O∞柏∞锄ATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTGAACACCTTAGAAACTGGAATTTCArGTCTAACl3GTTCTATTCCCGTrGAT6k,GGTGATTGAACACCTT／b,(3AAACTGGAATTl|CATG了CTAAcGGlTCTATTCCCGT了GATGAG6rGAT了GAACAcC了_『AGAAACTGGAATTTC611萄ACA丁GGk,ArATcATACTGACGATACTACrTGTAGrGCTTCAl3TATGl3CCAT71"ACAAGTACACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACACA71"GGAATA-fCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCA6TATGGCCATTACAA61"AC’2'．1明TC丁GTGTTCTTGTATGGTGTCAA6k,TGGCTATTCTATGGATACTTTGGCcrCTTGrGlTGTCTGTGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATl3GATACTTT13GCCTCTTGTGTTGTCTGTGTTCTTGTArGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACrTTGGCCTCl"rGTGTTG懈2硒13CACT(31C^CrTTl．TGATGCATGGGCTA6CTrCC^GGTCAACTGGGTCTTTTTCGCTTTCGCACrGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGClTCCAGGTCAACTGGGTCTTTTTC6CTTTCGCACTt3"1"CAcTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTCCAGGTCAACTGGGTCrTTTTCGCTTC241湖AGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGArAATGI"ATTTTGI"CAATAGCATTAGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTATTTGTCAATAGCAlITAGCATCCTT^TGGC丁TGC^TCACTCTrATGCTGTGGATAATGTATTTTGTCAArAGc^TT髓1秘'AAAGTGCTTCATTTAGTCTAAAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAA^AGTGCTTCATTTAGTCT^A图4-3三株疫苗序列M基因的序列比对Fig．4-3SequencecomparefortheMgeaeofthethreevaeelnestrains通过重组质粒的PCR和双酶切的电泳图片(图4．2)可以看出，获得了三个PEDV疫苗毒株的M基因的克隆，序列分析比较(图4．3)发现，三个疫苗毒株的M基因之间有两个疫苗毒株序列完全一样，另一个疫苗毒株有一个核苷酸的差异，说明三个疫苗毒株来源相同。29渤ccc描AAA掰AAA蠹}汀fJ髓冷玲玛辩旧心丙渤K¨¨描仆nn椭Mnn蠹}盯盯盯嘲∞∞∞润脶掩娲CGTCGTCTT『TGTGCGAGTCeCTT卜_AGATGCATACACTCGCGATATATATCTCTAGAGCAGTGTAGACGTGATGTT卜_TTCTGCTACGCeCTGTGCGTATGACGAG^AACAGCGTCACGCTCGCTT丁TACTT了CTT了]id—旦CATAGJqd)qTAGCTT了ATGTT卜．CGTCAT丁TAGCGCTGTCTGTGTGACeTCACTACTCATAGT^AATT了TT下CAGATCG丁TTACTACGCAA^AGACTGTGT丁TCGTGACTCGCGCATCGTT丁TA^AGCGCGTATCGCGTATAGCGTATATCeCTGAT^AACGC^AAGTGAGCA^AGC铷CCC蝴AAA缁AAA撇CCC辄GGG鲫TT 华中农业大学2013届硕士学位论文4．3PEDV全长eDNA的克隆图4．4~图4．12显示的是用于构建PEDV全长cDNA以及全基因组测序所需要各个片段(P1～P12)的克隆。Ml2342000looO750500250lOO图4_4P1的PCR鉴定Fig．4-4IdentificationofP1byPCRM：DL喇2000DNAMarker：1~2：Pl的PCR鉴定；3：P1阳性对照；4：P1阴性对照P1的大小为1300bp，PCR结果(图4．4)显示获得了P1的重组质粒，扩增条带在1300bp左右，大小与预期一致。M12345图4．5P2的PCR鉴定Fig．4-5IdentificationofP2byPCRM：DL俐2000DNAMarker：1：P2上的PCR扩增；2：P2下的PCR扩增3：P2上阳性对照：4：P2下阳性对照；5：阴性对照由于很难获得完整P2片段的重组质粒，因此试验将P2片段分为两个片段(P2上、下)分别扩增，大小分别为2100bp和1250bp，PCR结果(图4-5)显示获得了P2上、下的重组质粒，条带大小与预期一致，说明获得了这两个片段的克隆。30 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析Ml23452480bp图“P3的PCR鉴定Fig．4-6IdentificationofP3byPCRM：DL刑2000DNAMarker；2、3、4：P3的PCR扩增；l：阴性对照；5：阳性对照P3的大小为2480bp，PCR结果(图4-6)显示获得了P3的重组质粒，扩增条带在2500bp左右，大小与预期一致。M1M'l'’4‘65000bp2500bp图4-7P4和P5的PCR鉴定Wg．4-7IdentificationofP4andP5byPCRM1：DLa'M2000DNAMarker；M2：DLTMl5000DNAMarker；I、2：P4的PCR扩增；3、4：P5的PCR扩增；5：P4阴性对照；6：P5阴性对照由PCR结果(图4．7)可以看出，以P4和P5的重组质粒为模板通过PCR扩增得到了预期大小一致的P4和P5的片段，说明获得了P4和P5的重组质粒。3l 华中农业大学2013届硕士学位论文}嚣瓣图4--8P6的PCR鉴定Fig．4-8IdentificationofP6byPCRM：D∥2000DNAMarker；1：P6上的PCR扩增；2：P6下的PCR扩增；3：P6上阳性对照；4：P6下阳性对照；5：阴性对照将P6分为两个片段扩增，两个片段的大小分别为1855bp和1604bp，以重组质粒为模板扩增P6上和P6下获得了预期大小的片段(图4．8)，说明获得了这两个片段的重组质粒。、11～1，1，'4S^7R5000bp2500bp2000bp1000bp图4-9P7，瑚和P9的PeR鉴定rig．4-9IdentificationofP7，P8andP9byPeRM1：DLTM2000DNAMarker：M2：DLrMl5000DNAMarker；1：P7的PCR扩增；2：P8的PCR扩增；3：P9的PCR扩增；4：P4阳性对照；5：P5阳性对照：6：P6阳性对照：7、8：阴性对照PCR电泳结果(图4—9)显示，以P7、P8、P9的重组质粒为模板扩增获得了三个目的片段，片段大小与预期一致，说明获得了这三个片段的重组质粒。32 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析200010001800bp1600bp图4-10P10的PER鉴定Fig．4-10IdentificationofP10byPCRM：DP2000DNAMarker3、4、5：P10上的PCR扩增；6、7、8：P10下的PCR扩增1：P10上阴性对照；2：P10下阴性对照同样将P10分为上、下两个片段扩增，P10上、下片段大小分别为1640bp和1797bp，PCR结果(图4．10)显示，以P10上、下片段的重组质粒为模板扩增获得了预期大小的目的片段，说明获得了P10上、下片段的重组质粒。图4-11Pll的PCR鉴定Fig．4-11IdentificationofPllbyPERM：DL刑15000DNAMarker；2：Pll的PCR扩增；1：阴性对照；3：阳性对照以P11的重组质粒为模板进行PCR扩增，PCR结果(图4．11)显示获得了一条2900bp左右的条带，与预期的Pll条带大小一致，说明获得了Pll的重组质粒。 华中农业大学2013届硕士学位论文2000bp}俄)obp"／50bp500bp：50bp100bp图4．12P12的PCR鉴定Fig．4-12IdentificationofP12byPCRM：DLⅣ2000DNAMarker：1～2：P12的PCR鉴定；3：P12阳性对照；4：P12阴性对照P12的大小为1300bp，PCR结果(图4．12)显示获得了P12的重组质粒，扩增条带在1300bp左右，大小与预期一致。4．4体外转录和体内转录5’端和3’端的鉴定4．4．1体外转录的PEDV5’端和3’端的鉴定要保证获得的cDNA能够在体外转录，就需要体外转录所需要的5’端(图4．13)和3’端(图4．14)。M1'图4-13T7．PEDV5，端的PCR鉴定Fig．4-13IdentificationofT7一PEDV5’byPCRM：DLⅢ2000DNAMarker：1：T7promoter+P1；2：阳性对照将T7启动子直接合成在引物上，由PCR结果(图4．13)可以看出，获得了用于体外转录的含有T7启动子的PEDV5’端，条带大小与预期一样。34 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析图4-14PEDV-polyA3'端的PCR鉴定Fig．4-14IdentificationofPEDV-polyA5’byPCRM：DLlM2000DNAMarker；1：P12+polyA；2：阳性对照；3：阴性对照PCR结果(图4．14)显示的是用于体外转录的PEDV3’端的PCR鉴定，试验扩增3’端时在引物上加了polyA(含24个A)，片段大小约为850bp，PCR扩增结果与预期大小一致。4．4．2体内转录的PEDV5’端和3’端的鉴定要保证获得的cDNA能够在体内转录，就需要体内转录所需要的5’端(图4．15)和3’端(图4．16)。图4-15CMV-PEDV5，端的鉴定Fig．4-15IdentificationofCMV-PEDV5’byPCRM：DLlM2000Marker：1：P1PCR扩增；2：CMVPCR扩增；P3：PI+CMVPCR扩增；4、5、6：P1、CMV、Pl+CMV阳性对照；7：阴性对照由PCR结果(图4．15)可以看出，用重组质粒分别可以扩增出PEDV的P1片段、CMV启动子以及PI+CMV，并且条带大小与预期一样。说明获得了用于体内转录的PEDV5’端。 华中农业大学2013届硕士学位论文图4-16PEDV-HDV核酶．BGH3，端的鉴定Fig．4-16IdentificationofPEDV-HDVribozyme-BGH3’byPCRM：DL眦2000Marker；l：P12+HDV+CMV的PCR扩增；2：P12的PCR扩增；3：HDV+BGH的PCR扩增；4：阴性对照PCR结果(图4．16)可以看出，用重组质粒可以分别扩增出PEDV的P12、HDV+BGH和P12+HDV+BGH，条带大小与预期一致，测序结果显示P12+HDV+BGH片段上含有HDV基因，说明获得了用于体内转录的PEDV的3’端。4．5PEDVN基因的真核重组质粒的鉴定冠状病毒的感染性克隆的获得可能还需要N蛋白的参与，因此我们克隆了能够表达N蛋白的真核重组质粒(图4．15)。Ml】23M2B爨孵黧甓登孥纂嬲7500bp5000bp2500bp图4-17N基因重组质粒的PCR(A)和酶切鉴定(B)5400bpFig．4-17IdentificationofNgenebyPCR(A)andrestrictionenzymedigestion(B)(A)M：DLTM2000DNAMarker：1、2、3：N基因的PCR扩增；4：阳性对扎：5：阴性对照(B)M1：DL刑15000DNAMarker：M2：DLTM2000DNAMarkerl、2、3：重组质粒HindlII／XhoI双酶切36的pp0bO"昭∞ 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析由电泳结果(图4．17)可以看出，以PEDVN基因的重组质粒为模板，通过PCR扩增得到了预期大小的目的条带，大约为1300bp，对重组质粒进行双酶切鉴定，获得了预期的两条条带(pcDNA3．1(+)质粒和目的片段)说明获得了PEDVN基因的真核表达重组质粒。4．6疫苗毒株的基因组结构及分子特征用DNAstar将获得的覆盖疫苗毒株基因组全长的各个片段进行拼接。结果显示，PEDV疫苗株的全长为27953bp，基因结构为5’UTR．ORFl．S．ORF3．E．M-N．3’UTR，符合PEDV的基因组特征，基因组从5’端到3’端各部分的大小分别为292bp、12285bp、8037bp、4149bp、276bp、23lbp、68lbp、1326bp和334bp。疫苗毒株基因组的结构基因和非结构基因的上游含有所有冠状病毒都具有的TRS序列“XTA(G／A)AC"，在ORFl、S、ORF3、E、M、N起始密码子前的第85、8、46、10、11、15位核苷酸处分别为GTAGAC、GTAAAC、CTAGAC、CTAGAC、ATAAAC、CTAAAC。与其他PEDV毒株一样，在疫苗毒株5'UTR内部第95～133位核苷酸编码一个12个氨基酸的小肽，在这个小的ORF框上游28位核苷酸处也有一个与其他基因类似的TRSCTAAAC。在ORFla和ORFlb中间同样有一个典型的“slippery”序列(TTTAAAC)，核糖体通过识别这个序列，将ORFl分为ORFla和ORFlb两个多聚基因。在5’UTR和ORFl区域内，不同PEDV的毒株差异较小，只有少量的不定向突变和一些缺失、插入。以CV777为参考毒株，在5'UTR，其他毒株在第72和89～92核苷酸处分别有1个和4个碱基的缺失，在47～48个核苷酸之间有1个碱基的插入，但是这些插入和缺失没有毒株强弱的差异；在第3403～3426核苷酸处，疫苗毒株有24个碱基的缺失，这个区域编码木瓜样蛋白酶。疫苗毒株与其他毒株的核苷酸的同源性为97．1％～99．8％。其中与CV777参考毒株的核苷酸同源性为98％；与韩国DRl3弱毒株的同源性为99．8％，与2011年和2012年中国的流行毒株的同源性只有97．1％～97．2％。用MEGA5在全基因组的水平上分析疫苗毒株与其他PEDV毒株的遗传进化关系(图4．18)发现，疫苗毒株与韩国DRl3致弱毒株和2012年山东临床分离株SD．M的亲缘关系最近，与参考毒株CV777和中国2010年以前的分离株LZC、CH／S亲缘关系较近而与2011和2012年中国的分离的流行毒株亲缘关系较远。从进化树还可以看出韩国2007年的分离株DRl3与中国目前的流行毒株在一个分支上。 华中农业大学2013届硕士学位论文}————叫o．∞2图4-18PEDV疫苗毒株、参考毒株和其他分离株全基因组的遗传进化分析Fig．4-1SPhylogeneticanalysisofPEDVvaccinestrain，referencestrainsandotherisolatedstrainsbasedonthecompletegenomenucleotide▲：2010年以来的中国分离株；V：国外分离株；◆：2010前中国分离株；一：疫苗毒株：●：CV777毒株4．7疫苗毒株S基因的分子特征及序列分析S基因是PEDV变异最大的基因之一，其中S基因的变异位点主要出现在S基因的S1区域，S2区域相对保守。S基因的遗传进化(图4．19)分析显示：疫苗毒株、CV777毒株以及其他传统毒株和变异毒株可被分为3个群(Group)：G1、G2、G3。其中疫苗毒株属于G3，G3还包括CV777参考毒株、四个国外毒株(Brl／87、DRl3、83P．5、MK)和LZC、SD．M、CH／YNKM／2012毒株：G2包括3个2010年之前中国毒株JS．2004．2、DX、LJB0／03和2个2011年毒株CH22．JS、CHl3．GX；G1包括其他2011和2012中国流行毒株。序列分析显示所有PEDV毒株的S基因长度在4149b一161bp之间，以CV777为参考毒株，CV777S基因为4152bp，疫苗毒株、DRl3弱毒株以及两株中国2012年毒株SD．M、CH／YNKM／2012全长4149bp，与CV77相比，这4个毒株在第455～457位核苷酸之间有3个碱基的缺失；韩国毒株DRl3，日本毒株83P一5、MK，欧洲毒株Brl／87，中国2010年以前的毒株(JS．2004．2、LZC、LJB／03、DX)以及2株中国2011年分离株(CH22．JS、CHl3．GX)与CV777相比没有缺失和插入；中国201138 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析和2012年的其他毒株全长4161bp，与CV777相比有较大的差异，在163～164位、179～180位、193～194位、403---404位核苷酸之间分别有3个、12个、1个、3个碱基的插入，在第205和465--470位核苷酸之间分别有1和6个核苷酸的缺失，其中广东和广西的3个毒株GD．01、GD．A和CH／GXNN／2012在S2区域的第3589～3591位核苷酸还有3个碱基的缺失，这三个毒株全长4158bp(图4．20)。疫苗毒株与G3其他毒株的核苷酸(氨基酸)序列的同源性为96．3％99．9％(95．6％-99％)；与G2的同源性为95．8％、一96．3％(94．9％一95．6％)；与Gl的同源性为93．7％95％(92％,-,93．4％)。序列比对显示，疫苗毒株与G1和G2群的毒株在氨基酸序列上有很多差异点，G1包含的全部是2011和2012年的毒株，可以认为是变异毒株群，G1毒株相对于疫苗毒株来说有32个共同的氨基酸突变(27Q(疫苗毒株)-S(G1)、28S．A、29T-N、30I-T、55S—I、56M·G、57N-E、58S-N、60S·T、64G-A、65T-G、66G-Q、67I-H、68E-P、80Y-H、82D-R、83S—G、85Q-H、116I—T、155G-H、156K-S、173A—S、195K-S、196R-G、197S—G、205T-E、224E-Q、227Y-S、231S-I、242S-P、299M·I、308A．V)；在第58～59、133～134位氨基酸之间还分别有4个和1个氨基酸的插入，在第157、158位点还有2个氨基酸的缺失，其中GD．01、GD．A和CH／GXNN／2012在第1192位还有1个氨基酸的缺失；还有26个氨基酸位点是G1、G2所共有但是与疫苗毒株不一样(2T-K、5I．T、15L．S、70D．A、177C．Y、281W二L、323F．S、353K—L、355I-T、357T-A、362v-A、364E—Q、593G-S、632Q-E、763L-S、765D-G、890G．K、972N．Y、1022N．R、1039K．N、1043S．A、1072G．D、1166D．A、1231S．R、1259I．T、1297R．Q)，可以看出这些突变主要发生在S1区域(47个)，只有小部分出现在S2区域(10个)。对CH／FJND．3／2011毒株来说，在第972位氨基酸为H、在第890、1022、1039、1043、1172、1166、1297位氨基酸与疫苗毒株一样，因此在进化树上尽管CH／FJND．3／2011属于G1，但是却为一个独立的分支，与疫苗毒株的关系较其它毒株更近。序列比对显示，在可以诱导产生中和抗体的COE区域，疫苗毒株与G1有2个氨基酸位点的突变(593G．S、632Q．E)，在线性表位SlD也有2个氨基酸位点的突变(763L．S、765D．G)。在S蛋白N端的25～88aa这个预测的PEDV受体结合位点，变异毒株与流行毒株有18个氨基酸的突变和4个氨基酸的插入。在另一个预测的受体结合区249～529aa，疫苗毒株与流行毒株有9个氨基酸位点的差异(281W-L、299M．I、308A．V、323F．S、353K．L、355I．T、357T-A、362V_A、364E．Q)(图4．21)。39 华中农业大学2013届硕士学位论文G1G3图4-19PEDV疫苗毒株和参考毒株的S基因的遗传进化分析Fig．4-19Phylogeneticanab毽isofPEDVvaccinestrainandreferenceswainsbasedOntheSgene▲：2012年中国毒株；V：2011年中国临床毒株：0：国外毒株：◆：2010前中国临床株；■：疫苗毒株；●：CV777 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析“"7l^F353611)V∞洲i‘c1鞠鲥1翻哺拊^∞12J功1都柏IoR{3捌蝴翎昭$D-辅且辅0糟{}§3p-§柏S惦61e}峨^B5‘8钢I蓐棚a^懈鸷o．{DXl￡∞31e∞1鲫射izZ■犯}U酾Ioc嬲弼O．Z22-JslJGm瑚jCHl≥．G)c{jc掰9搦iDRlXJQ站3撼11Lzcf守坞S口螭}e．∞1t,．4(JX4353Q1{CH俘*函恫叫Jc哼艄1}G扛^铆臻÷蜉四o{霸取口{8，79}CHC,D-Oli鼻国∞聃酊CHl7-C,Zl∞9磁翻c}协CC’ta'i．黼1描)§埘豫-≈Jx掰期j}t．≈12．轴X∞5∞3I心^搿2积512∞7IFa门壤计2f且2S哺霸j翻鬟删，她搬㈣№嚏J。5，狞A}“∞11-丑J^麟711)№Ⅲ2．20’2{翰4麟}Jx‘2铆21．‘c2对∞玎^她2。镭Icc2蛇蝴I动1^瓣17；I(Q暂9∞{洲f舯榭}’斌口l撙哺CV玎7(AF3S葛”1V∞嘲tCl869441翻mtn憎'每J墙'釉∞}ORl3^趣Jc∞3t62}S凸蠊矗两∞6{}§3p·鬟柏5l赫诣I嫩嫱5培救舢嚣瑚啊·a脯5320l}Qxf￡∞3{e翦}酾愆锰粼}L渤I。o辩S渤渊麓姻Jo孵§瑚)CH，嫩．Io村昭嗨)oIllXJ0023151)LZQ轷Ie算蚴HB一∞11．4(JX435301)铷悔拙删柏甜9奢1)GO-A翻愆掰谨O谨UX01S’抽}CHC．,O州黄西∞鼬)翎，7∞露J09均2翦1翻堪C托一“j糙翻麓翦¨勰≈·鑫“∞53。oj懈一萄’善2(JXl3§∞弘HLJ．蝴2抽X51西07}F嵇H黼斟∞S韩谨)CH巷Dc《垃口1{∞63瞻1朝№晡jQ5t72{+4}∞·萄tt-2J}毒荔?tt；}●●Ⅲ2．20谨f翩糊}jx‘2012献C2制jAH2．∞12fKC242901IzJl^∞，2取盘娜}CH手扣002。f!t,,102t㈣俺tCT^C柏1TT^C’7口GT^TG^^CTCTCTA^G^^G^AG^^e^^G^^4loATG^TGTTGCAGGGC^GGGCAGGGC^GGGCAGGGC^GGG1瓣1钟∞O2’。31弱^^CT^A^GAG^^A^A^A^Jit．^3{轴^C惦130,140150哟470^C^^C^GGTCGT^^CTGCCTATTCAACA^^GCC^TTCCAGCTGTCG￥TTTGCGTG^^G^AG^GAG^GAGAG^^^G图4-20PEDV疫苗毒株和其他毒株S基因的主要缺失和插入位点4-20ThedeletionandinsertioninSgeneofPEDVvaccinestrainandotherstrains注：图中阴影区域显示的是插入和缺失位点4lC^^^^^^^GC^GCeC，CeC^C，TG^^^^^^^^^^^^^^^^^^^G^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^CTTtTTtTT『TTGCGC^，CGCTT丁TTTtTT了TG^^^^^^^^^^^^^^^^^^^CT7ITT，TTrTiTiT，，t●t，，，t●C 华中农业大学2013届硕士学位论文v|∞11皇(I《c糟9舛舢嚣≈o‘．a^掩532。lDXE嘲1霉∞LJ8鼬船O蒋5739IC}谨．始J。9挎挪IV；momw(愆循99¨1Js．排a脯螫2∞O麓勘∞1橱劲啪GT"JglC}啦-疽JOkeR290l礼鬻≯NFRRFF⋯SKFN．VOAPAVVVL—GGYLP烈霾?鬓秽。燃攥掣6Ft灌繁、j童"嚣．¨麓“$戮j，颤羹，10曩番鬣嚣．麓鬻^．鬻!．，j、．⋯．o．o瀵糕+_||}’’溪分．罐鬻．熏o+oo-浚鬻陵蓊嚣。隧摹^懑薹l毒蓦辩叠每￥冀熏蔫蔼n鞫妻囊瓣羲疆萋表熊}。鑫E拍毒8V冀霉、鲻奄嚣霉籍V张藉磊零豢#薹}’《E#曩翻鬟≮j!I_《女麟霉V囊缸毪骜霪萋摹1游葺纂囊囊箩磋鬟羹鸯巷鬻塞篝v耩藏誊§麓$萋．{．’髓i鑫碜￥自l募Iij|Ii|l自警篱v甏躺萼熹蓑￡}篝￡萎蚕删爿萋舞；il囊t|I≥粪V篝jiI鹰菱曩懿{盛鬟舞囊G铡l羹誊羹H￡．鬻V、目j：}磊零蓑黧毒{《§躺《甥餮雾舔鸯囊￡篝v舞舞毒鑫蓑|!l塞}髓#蕻每g篝爹．jI绷i羹篝v拜蠢霉§i翼萋，。鑫￡I}I囊§￥糍萋彝毒番M《鬟V髯纛口萋轰|||I薰{零巍躺l赫囊舞的髑藓V势躺豢^簿l￡嚣l耩镬ev薄l囊巷自*羹鬻V獭{淄毫莲憋．i零薹篝蠢鳃囊萋萋鳓靖毒鬟v蠢蠢蠢霉1II；i辩零l鑫羲箝彝话譬瓣囊篝疆毪辩募篱v稿囊拈；．：势‰孽3∞?螺挈图4-21PEDV疫苗毒株与流行毒株受体结合位点的氨基酸突变Fig4-2lTheaminoacidsmutationinthereceptorbindingregionofPEDVvaccinestrainand’prevalentstrains注：图中阴影区域显示突变位点，方框内显示的是流行毒株4．8疫苗毒株OFR3基因的分子特征及序列分析以CV777作为参考毒株，序列分析显示，疫苗毒株在245-293之间有49个碱基的缺失，由此导致了后面序列的ORF框发生变化，最终编码一个包含91个氨基酸的缩短的蛋白，疫苗毒株的ORF3包含276个核苷酸。ORF3是PEDV变异较大的基因之一。以CV777为参考毒株，疫苗毒株、CV777弱毒株、DRl3弱毒株和CH／GSJIII／07在245～293位核苷酸之间都有49个核苷酸的缺失，CH／GSJIⅡ还在第417--419位有3个核苷酸缺失，Brl／87在第413~415位有3个核苷酸缺失，CH／GSJII／07在第416～418位有3个核苷酸缺失。经过序列分析发现，PEDV的2个弱毒株、疫苗毒株和CH／GSJIII／07ORF3的核苷酸序列完全一样，因此可以说明CH／GSJIII／07毒株是弱毒苗免疫后排毒造成的，但是CH／GSJIII／07毒42a口口奄aQ。Oa口Oa口Q口O心OQQO口Oa^^^^^^^^A．^^^^^^^^^^^^^^^T^^．^^^^冀i^．。^^_‘纛A鲁。再^舂。^1^。^^矗^。^￥●，{彳l。l，-，蔓IfT￥，，Jr，-，，}}．，f，-，t．麓攀雾尝零藿鍪墼雾纛錾裂蕊蛩袋摹魅鎏蕊鬣群菇罄鏊蔗鬈瓣￡搬霪警I攀蠢bo蔷SS嚣骞$S暑S3S●口鑫$差^●≈_e_#ot”S^口Syr-萎i4{，．，，■毒l^≮藿一十，v．3，墼．i_lH}{手4，f一．。¨羹戥髯錾秘嚣，≯”批黔“簿黔静群嚣弘鑫_錾群黔豁錾姥一 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析株与CV777相比还另外有3个核苷酸的缺失(Brl／87、CH／GSJII／07在附近也有相同的缺失)(图4-22)。除了弱毒疫苗与临床毒株相比，ORF3有49个碱基的缺失外，没有在ORF3内部发现有明显的强弱毒株倾向的突变。以ORF3分析PEDV毒株的遗传进化关系(图4．23)，根据进化树可以将PEDV分为3个群组(Gl、G2、G3)，其中G1又可分为3个亚群(G1．1，G1．2，G1．3)。其中DRl3弱毒株、CV777弱毒株、CH／GSJII／07、CH／HLJHH．2／201l和疫苗毒株一起被分在G2；G3包含两个欧洲毒株(CV777参考毒株、Brl／87)和两个中国毒株(JSSH2008、LZC)；2个韩国毒株DRl3、Chinju99，5个中国2010年以前的分离株毒株CH／HLJM／07、CH／JL／08、CH／SHH／06、CH／S、CH／GSJIII以及其他的2010年以来的中国毒株被分在G1。CV777(AF'3535'1'vaccinef}‘C189944}DRl3An(JQ023162)CWGSJmf07{GLb727431CV777^i婀U3727441CHJ3YIl2(JX501332}JSrs20j2fKcl611∞1AH201，fKCl61{86)AHQJ2012(KCl6118B}P229(KC'207蚺)SC1’08矧Jx87838312J120∞i(JX880080lZJ111益5fJ瑚80。79)TJNH-，203(Kc294280j81981iH0537434)M2366(HQ537440)CH『SDc0渤1，{J07蔓9511C刚惜翎翻20'I(XT064301}C啡SH瑚{{fJ06642鹳}FJ／P玎’1fJc晤7∞4∞CMLCCf2们1f．10664302)C心GXW拜2011fJ06642981CⅢ舢岬各2011(J0305099Chinju瓣(EU792474}DRl3(EU054929}CH／I-EJP／06(GU372732)CHtJLJ08(GU372734}CWHNCW06(GU372738}CWSHH_|06(GU3727401CH．,GSJ啪7(GU3727421CH．IHLJMt07(GU372735)CW射Tm6(GU372739)CWJb舟CJ(GU372741)LzciEFl859堑lBrli87(Z24733}CH，s(JN547228)GD-A(JXll2709)Go．8(J)(088鹋5)8J．2011-1(JN8257{21JssH2008fKCl611951CH，TH012{Kcl柏5251AHH(JX501743}C心mO黼0(JN547395)C坩PDSBFI|1fJ}6473雏I241一嘲CTCTI^TT8CeC^Ci；蘸TA260270280290Tf芎了磊t^TTACYGT．GGTGC熏CTTT"r篱C,AT蠡eA^CtAXT^TT。一⋯i‘*⋯，-^’⋯’¨：．蔓!’。’’‘÷麓：。"，麓¨’-⋯’鬟麓⋯’—?’’量≯一’。⋯o气J!!I_j磐l·甍≥·一c引瓣瓣t蓦I_《曩*‘基÷··一专j豁蝌·一t··≥黧÷慧一-一c．誊￡鬻l鏊鏊羹0，二誊誊§鞲誊耋o-i粪黧誉童．，0建冀l曩．i；{}“。。瑟瑟i篓I=，《，●c·7％j；一Ⅳ‘_“’_。一i‘i。“!!一!一■4，14’‘?，!、⋯。。，?，‘。⋯‘搿’。。。。o，一，+’。’。oC411420430TTATTATG^CGGCAAATCCAC圈T蘑圈图4-22PEDV疫苗毒株和参考毒株ORF3的主要缺失和插入位点TGC4-22Thedeletionandinsertionin0Rli．3ofPEDVvaccinestrainandreferencestrains注：图中阴影区域显示的是缺失位点43 华中农业大学2013届硕士学位论文3G1．1G1图4-23PEDV疫苗毒株和参考毒株的ORF3基因的遗传进化分析Fig．4-23PhylogeneticanalysisofPEDVvaccinestrainandreferencestrainsbasedontheORF3▲：2012年中国毒株；v：2011年中国毒株；0：国外毒株；◆：2010前中国分离株；●：疫苗毒株：●：CV777毒株 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析4．9疫苗毒株M基因的分子特征及序列分析M基因是PEDV较为保守的基因，序列分析显示所有毒株的M基因序列都为681bp，编码226个氨基酸，没有缺失或插入的情况。由M基因的遗传进化关系(图4．24)可以将所有的PEDV毒株(包括疫苗毒株)分为3个群G1、G2、G3，G1群又分为4个亚群(G1．1、G1．2、G1—3、G1．4)。其中疫苗毒株属于G3，G3还包括参考毒株CV777，因此G3群可以被认为是传统毒株群，本群还包括韩国的DRl3弱毒株和中国2010年以前的3个毒株(CH／S，CH／JSX06，HN．XYYYP．2007)和2010年以后的两个毒株SD．M、GDYEl0；G2包括2个韩国分离株(KPED．9，chinju99)和1个日本分离株JM2，G1．4包括2个中国分离株(CH／HLJ／06和DX)，G1．3包括2个韩国毒株(DRl3和V2501)，G1．2包括4个毒株(JS．2004-2、Guangxi．12、GD．A、GD．01)，G1．1包括其他的中国2010年以来的分离毒株和2个泰国毒株(07NP01、08NP02)和一个韩国毒株PFF285，而G1．1和G1．2被普遍认为是变异毒株。疫苗毒株与Gl的核苷酸(氨基酸)同源性为970／'o．-,99．1％(97．8～98．6％)；与G2的核苷酸和氨基酸同源性为97．9％98．8％(97．3％～98．6％)；与G1．1的同源性为97％～98．5％(97．3％--,98．6％)；与G1．2的同源性为98．2％～98．7％；与G1．3的同源性为98．1％98．2％(98．2％～98．6％)；与G1．4的同源性为99．O％～99．1％(98．2哆扣98．6％)；与传统毒株的同源性为97．40／旷100％(97．6％～100％)。疫苗毒株与2010以来分离的变异毒株核苷酸(氨基酸)的同源性只有97．4％～98．5％(97．8％～98．6％)，与2010年之前的变异毒株核苷酸(氨基酸)的同源性为98。7％-99．1％(98．2％-98。6％)。比较疫苗毒株与变异毒株的核苷酸和氨基酸序列发现，相对于疫苗毒株来说，变异毒株有7个位点的核苷酸发生突变(125T-C，213C．T，234C．T，285T-C，348T-A，495G．A，499G．A)，但是只有第125位和第499位的核苷酸突变引起引起了其编码氨基酸发生变化(42v-A、167D-N)，其中在第42位氨基酸的突变很有意思，在序列分析时发现，当把传统毒株在这个位置的氨基酸由V变成A时，根据氨基酸序列做的遗传进化树就把这个传统毒株分在变异毒株群。45 华中农业大学2013届硕士学位论文G1—11—2G3G1图化4PEDV疫苗毒株和参考毒株的M基因的遗传进化分析Fig．4-24PhylogeneticanalysisofPEDVvaccinestrainandreferencestrainsbasedontheMgene▲：2012年中国毒株：v：2011年中国毒株；a：2010年中国毒株；O：国外毒株：◆：2010前中国分离株；■：疫苗毒株；●：CV777毒株 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析4．10疫苗毒株N基因的分子特征及序列分析N基因也是病毒的保守基因，但是经过序列比对发现，不同PEDV毒株的N基因还是有一定的差异。N基因的遗传进化分析(图4．25)表明，所有PEDV毒株可被分为2个群组G1和G2，其中G1又可分为3个亚群(G1．1、G1．2、G1．3)。其中G2包括疫苗毒株和CV777参考毒株，83P．5以及LZC、CH／S和2010年以来中国的一些毒株SC、CH／ZJHZ／2011、CH／HLJHH／2011、CHIHLJQ／2010。G1包括已经被证明是变异毒株的毒株和一些2010年以前中国的毒株。其中G1．1中的BJ．2011．1、FJND．3和G1．3中的GD．A、GD．01是被证实的PEDV变异毒株，因此可以认为G1．1和G1．3属于变异毒株群，但是JS．2004．2也被分在G1．1中，值得注意的是G1．2包含了中国2006年的四个毒株CH／JSX／06、CH／HLJH／06、CH／HNCH／06、CH／SHH／06、一个2003年毒株LJB／03和韩国毒株DRl3。疫苗毒株与其他毒株的核苷酸(氨基酸)的同源性为95．70／o~99．5％(95．9％～99．8％)；与参考毒株CV777的同源性为97．5％(97．7％)；与G2其他毒株的同源性为96．6％99．5％(96．8％～99．8％)；与G1的同源性为95．7％～97．3％(95．90／旷97．5％)；其中与G1．1的同源性为95．7％97．3％(95．90／0---97．5％)；与G1．2的同源性为95．90／o---96．8％(96．2％97．1％)；与G1．3的同源性为96．2％～97．1％(96．8％～97．3％)。不同毒株的N基因的核苷酸序列有缺失或插入，以CV777作为参考序列，CH／ZJHZ／2011和CH／HLJHH／201l在第35和36位碱基之间各有一个碱基插入；两者分别在第32和44位碱基的地方各有一个碱基的缺失，因此并没有导致两个毒株阅读框发生改变，其他毒株未见缺失和插入。分析疫苗毒株与变异毒株的核苷酸差异发现变异毒株有11个碱基的突变(102C．T、360T-C、407G．A、425G．A、441G．A、726A．T、1056C．T、1119A．T、1139T-A、1239C．T、1249C．T)，并引起5个对应的氨基酸突变(136G．E、142A．T、242H．L、380I—K、397Q—L)。47 华中农业大学2013届硕士学位论文}—————————叫n铷51lG1—3删lJG2图4-25EDV疫苗毒株和其他毒株的N基因的遗传进化分析G1Fig．4-25PhylogeneticanalysisofPEDVvaccinestrainandotherstrainsbasedOntheNgeneAk：2012年中国毒株：V：2011年中国毒株：△：2010年中国毒株：O：国外毒株；◆：2010前中国分离株；■：疫苗毒株；●：CV777毒株48 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析5．讨论5．1疫苗毒株的同源性分析本实验选取了不同省份猪场的三株PEDV弱毒疫苗，序列分析发现三株PEDV疫苗的M基因有两株完全相同，另外一个毒株有一个核苷酸的突变，因此可以确定这三个疫苗来源于同一个毒株。5．2关于疫苗毒株与参考毒株的全序列分析全基因组序列分析表明，PEDV疫苗毒株与中国2010年以来的PEDV临床毒株的全基因组序列同源性只有97．1％"97．7％，说明它们之间的序列差异较大。从全基因组的进化树可以看出疫苗毒株与2010年以来的毒株亲缘关系较远，可以推测弱毒疫苗只能提供有限的免疫保护，可能是因为变异毒株主要抗原位点发生了改变。从进化树还可以看出韩国2007年的分离株DRl3与中国目前的流行毒株在一个分支上，说明他们之间的亲缘关系较近，推测目前中国的流行毒株很可能来自韩国。另外疫苗毒株与山东分离株SD．M毒株的同源性高达99．8％，很有可能是弱毒疫苗免疫猪体后，又从猪体排出，使用弱毒疫苗可能使没有病毒的猪场存在病毒，所以猪场PEDV弱毒疫苗的使用应该谨慎。5．3关于S基因的序列分析S基因也是PEDV变异最大的区域。所以S蛋白的序列分析对研究不同PEDV毒株之间的进化以及疫苗毒株与流行毒株之间的差异有重要的作用，特别是对S蛋白的SD和COE中和表位、以及与细胞的S受体结合区域进行分析，S蛋白也是PEDV遗传进化分析的最常用的基因(LiZLetal2012：LiWetal2012)。疫苗毒株与变异毒株S基因的核苷酸(氨基酸)的同源性只有93．7％～95％(92％．93．4％)，说明疫苗毒株与变异毒株的同源性很低。从S基因的遗传进化关系可以看出，疫苗毒株与变异毒株的亲缘关系较远。另外从进化树可以看出2010年以来中国的临床毒株既有变异毒株也有传统毒株，这为猪场PED的防治带来了困难，也能说明目前的弱毒疫苗只在特定的猪群有效果。变异毒株与传统毒株相比，在S基因内部有很多缺失和插入，这可能是导致变异毒株毒力增强的一个原因(LiWetal2012)。尽管G2(2010年前的分离株)从遗传进化关系上与G3(疫苗毒株群)更接近，但序列分析表明，G2与G1(变异毒株群)的同源性更高，因此推测，也许G1变异毒株就是有G2毒株进化来的。PEDV的S蛋白的中和表位(COE，499～638aa)，线性表位(744～759aa“GSIGYVPLQDGQVKIA”、756～771aa“VLVYSNIGVCKSGSIG”)区域是诱导机49 华中农业大学2013届硕士学位论文体产生中和抗体的重要区域(ChangSHetal2002；SunDetal2008)，变异毒株相对疫苗毒株在S蛋白的中和表位区域(COE和SD)都有共同的氨基酸突变，这些突变可能引起病毒免疫原性的变化，从而导致疫苗诱导产生的中和抗体不能有效的抵抗变异毒株的感染。S蛋白N端的25～88aa是预测的PEDV的受体结合位点(LeeDetal2011)，序列比对发现疫苗毒株和变异毒株在这个区域内有16个氨基酸的突变和4个氨基酸的插入。在另一个预测的受体结合区249～529aa(孙东波等2009)，疫苗毒株与变异毒株有7个氨基酸的差异，这些突变很可能是造成病毒毒力增强的原因。5．4关于OI心3的序列分析ORF3是PEDV变异最大的区域之一，也是区分PEDV临床毒株与疫苗毒株的标记，ORF3对病毒的复制不是必需的，但却对病毒的毒力有重要的影响(YounSetal2005；WangKetal2012)。从ORF3的遗传进化关系可以看出，根据ORF3进化树不能很好区分强弱毒株，很明显的就是CH／S毒株与2010年的中国分离株在一个分支，疫苗毒株与所谓的变异毒株的亲缘关系也很近。序列分析显示，相对于CV777，疫苗毒株在ORF3有49个碱基的缺失，由此导致了后面序列的阅读框发生变化移码，在中间产生一个终止密码子，最终编码一个包含91个氨基酸的缩短的多肽，疫苗毒株的ORF3包含276个核苷酸，这也是PEDV疫苗毒株的共性(ChenJetal2010)，研究表明正是这49个核苷酸的缺失才造成病毒毒力的下降(ParkSetal2008)。分析PEDV疫苗毒株与临床毒株的ORF3核苷酸序列发现，CH／GSJⅡ加7毒株与疫苗毒株一样有49个核苷酸的缺失(ChenJetal2010)，说明CH／GSJI]I／07是疫苗免疫后的排毒，但是CH／GSJIII／07还另外有三个核苷酸的缺失，这3个核苷酸的缺失是不是疫苗毒株在猪体内复制后造成的，还需要验证。5．5关于M基因的序列分析对于PEDV来说，M基因很保守，M蛋白是PEDV重要的抗原蛋白之一。所以分析M基因与参考毒株和流行毒株的差异也有重要的意义(YangXetal2012；ChenJFetal2008：LiZLetal2012)。PEDV疫苗毒株和变异毒株的M基因核苷酸(氨基酸)同源性只有97％～98．5％(97．3％98．6％)，说明疫苗毒株与变异毒株的亲缘关系较远。另外从M基因的遗传进化关系也可以看出疫苗毒株与变异毒株的亲缘关系较远。从M基因的遗传进化关系来看，早在2004年我国就出现了变异毒株JS．2004．2，同一个分支的流行毒株GD．A、50 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析GD．B、Guangxi．12很可能是从这个毒株发展来的。中国2010年以来检测到的其他变异毒株与韩国和泰国在2007和2008年的分离株亲缘关系也非常近，这些变异毒株可能通过引种传播来的，Li等在研究S基因时也发现这种现象(LiWetal2012)。因此我们猜测变异毒株可能很早就在我国猪群存在，可能因为当时变异毒株只在很小的范围内存在，加上其造成的临床症状与TGE非常相似，所以当时没有被人们重视，随着地区间交流的增多，最终导致了变异PEDV在2010年以后的流行。对于中国的PEDV毒株M基因来说，传统毒株与变异毒株有一个很大的区别就是第125位碱基的突变，所有的传统毒株在这个位置都为T而变异毒株为C，由此引起其编码氨基酸的变化(V-A)，并且发现将传统毒株此位置上的V改变成A后，传统毒株在进化关系上就被分在变异毒株的行列，因此推测此位点有重要的生物学意义，可能是引起M蛋白免疫原性发生改变的原因之一。还有一个值得注意的是变异毒株在M蛋白的第192位或214位的氨基酸一定含有一个丝氨酸(S)，而传统毒株没有发现这种现象，这两个氨基酸也位于预测的膜外区，丝氨酸有助于机体抗体的产生，这也许是病毒M蛋白的抗原发生变异的原因之一。以上可以看出，不管是从遗传进化关系还是从核苷酸和氨基酸的同源性来讲，疫苗毒株的M蛋白都与变异毒株有较大的差异，由于M蛋白是PEDV的主要的膜蛋白之一，这些核苷酸或氨基酸的突变可能造成了免疫原性发生变化，而导致疫苗的免疫效果下降。5．6关于N基因的序列分析N蛋白是PEDV核蛋白，是诱导细胞免疫的重要成分，在机体抵抗病毒入侵的过程中也发挥有一定的作用(SaifLJ1993)，是影响疫苗免疫力的因素之一。虽然N蛋白是PEDV较为保守的蛋白，但是经过分析发现疫苗毒株与变异毒株还是有一些共同的差异(LiZLetal2012)，其中所有的传统毒株在第425和第726位核苷酸倾向于G、A，而变异毒株倾向于A、T，对应位置的氨基酸分别由A、H变为T、C，这些氨基酸位点的突变是否是造成变异毒株毒力增强或者病毒N蛋白免疫原性的变化还需要验证。另外从N蛋白的遗传进化关系也可以看出，在2010年之前，中国就已经有变异株存在，Li等研究也显示，PEDV目前的流行毒株与JS．2004．02、LJB／03、DX等很接近(LiZLetal2012)。从进化树还可以看出目前中国猪场中PEDV的流行情况是传统毒株与变异毒株共存。虽然疫苗毒株与变异毒株的N蛋白在核苷酸序列和氨基酸序列上没有明显的差异位点，但是疫苗毒株与流变异毒株的核苷酸(氨基酸)的同源性都比与传统毒株低，在进化关系上也有较大的差异，说明疫苗毒株与变异毒株的亲缘关系很远，可能导致机体针对疫苗毒株N蛋白的抗体对变异毒株的保护力不够。 华中农业大学2013届硕士学位论文由以上的讨论可以看出，目前我国猪场流行的变异毒株无论在核苷酸和氨基酸的同源性方面还是在遗传进化方面都与PED弱毒疫苗毒株有较大的差异，从而能够说明疫苗不能给猪群提供很好的免疫保护，因此需要基于变异毒株研究一种新的疫苗来预防PED。5．7关于PEDV感染性克隆的构建目前构建冠状病毒全长cDNA的方法有3种：(1)在体外连接(YountBetal2000)；(2)利用细菌人工染色体(BAC)作为载体(AlmazanFetal2000)；(3)利用痘病毒作为载体(T11ielVetal2001)。本实验用BAC载体，这个载体在细菌内只有l~2个拷贝，保证能正确的复制和稳定的存在；利用BAC载体系统进行片段的缺失、插入非常方便。获得PEDV的感染性克隆的重要一步就是获得真实的全长cDNA(赵卓2004)。但是在构建PEDV各个片段重组质粒的过程中，发现有些片段不能在大肠杆菌中稳定存在，很难获得正确的克隆，主要表现为以下几种情况：(1)得到的转化子经过PCR鉴定以后得到的条带比目的片段要小很多；(2)得到的转化子经过测序以后发现中间插入一段细菌自身的序列；(3)得到的阳性克隆的目的片段有大量位点的突变；(4)得到的转化子只含有质粒，不能获得插入目的片段的克隆。很多实验室在构建RNA病毒的感染性克隆的过程中也都遇到了重组质粒不稳定的难题(SumiyoshiHetal1992)。对于PEDV来说，不稳定的片段主要集中在ORFl片段，本试验最初设计P2、P6、P10三个大于3kb的片段，不断重复转化、鉴定，就是不能获得正确的克隆，甚至降低培养的温度(LaiCJetal1991)，增加连接反应的时间，缩短培养的时间(黄莺等2003)，．更换低拷贝的载体也不能获得正确的克隆。最后试验通过引入酶切位点的方法将3个大片段分成6个小片段去扩增，再进行连接，引入的突变位点也可作为克隆毒株的筛选标记。但是在构建P6下这个片段的时候，即使只有1600bp，依然不能获得正确的克隆，最终在不断的重复的过程中，才获得了这个片段的正确克隆，经过分析，这个片段位于PEDV的RdRp区域和金属离子结合区域之间，这个区域可能存在对细菌有很大毒性的片段。有两种转录方式可以获得具有感染性的RNA，体内转录和体外转录，两者各有优点。体内转录就是在细胞内转录，需要真核启动子(CMV启动子)和真核转录所需要的终止子(polyA+HDV核酶+BGH)(AlmazanFetal2000)，CMV启动子能够保证病毒利用细胞的RNA聚合酶进行转录，polyA+HDV核酶+BGH的作用是保证转录出的病毒带有正确的3’端RNA，还能够保证转录的终止。体外转录需要体外转录启动子(例如T7启动子)和终止信号，在RNA聚合酶的作用下，在体外利用NTP转录成RNA(YountBetal2000)。 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析本实验构建了覆盖PEDV疫苗毒株基因组全长的重组质粒，以及用于体内转录的5’端(含CMV启动子)和3’端(含polyA+HDV核酶+BGH+polyadenylation)以及体外转录所需要的5’端(含T7启动子)和3’端(含polyA)，为PEDV感染性克隆的构建打下基础，并且在构建重组质粒的过程中引入突变位点，以区分转录获得的病毒和亲本毒株，在构建重组质粒的过程中还沉默了一个基因组内部的NotI限制性酶切位点，从而保证获得的全长cDNA，可以插入到BAC载体中。构建好覆盖基因组全长的各个片段的克隆后，我们尝试在体外对片段进行连接，但是一直没有获得成功，主要是因为我们的各个片段的长度都太短，增加了连接的工作量，这也是当时设计试验时没有想到的。 华中农业大学2013届硕士学位论文6．结论6．1完成了PED弱毒疫苗毒株全基因组序列的测定及分析；6．2无论在基因组全序列水平还是在S、ORF3、M、N等基因水平，疫苗毒株与变异毒株的亲缘关系都较远，同源性也很低；6．3构建了覆盖PEDV基因组全长各个片段的重组质粒。 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析参考文献1．葛俊伟，姜艳平，汪淼，等．表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答．生物Z翟学按．2009，25(06)：813．818．2．葛俊伟，姜艳平，汪淼，等．猪流行性腹泻病毒S1蛋白在干酪乳杆菌中的分泌表达及免疫原性分析．乒厚颜；劳辔屠学≥贸．2009，31(04)：256．260．3．葛俊伟，姜艳平，汪淼，等．表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答．≠厚考医科学2010，40(07)：708．712．4．黄莺，贾丽丽，孙志伟，等．流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得．疬莓学按．2003，19(04)：313．319．5．李建强，柳纪省，兰喜，等．猪流行性腹泻病毒纤突蛋白基因克隆与序列分析．农业生物技术学报．2007，15∞吣562．566。6．李树根，李力复，李力施，等．猪流行性腹泻病毒的分离及适应传代细胞培养病毒株的建立．乒厚营禽终黼1993(06)：1．5．7．陆承平．兽医微生物学[M】．第三版．中国农业出版社，2001：546．556．8．吕茂杰，陈建飞，时洪艳，等．猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析．缴生物学报．201l，61(05)：643．647．9．马思奇，王明，冯力，等．猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联氢氧化铝细胞灭活疫苗的研究．乒国芎禽传染痈1995(06)：23．27．10．马思奇，王明，周金法，等．猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗免疫效力试验．乒国宣禽劈染藏1994(02)：15．19．11．孟凡丹．猪传染性胃肠炎和流行性腹N--联核酸疫苗免疫效力研究[硕士学位论文】．东北农业大学，2011．12．钱永清，闻人楚，唐永兰，等．猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定．上游．农业学报．1999，15(02)：41．44．13．上海市农科院畜牧兽医研究所猪传染性胃肠炎病课题组．鉴定“猪传染性胃肠炎”华株病毒为猪流行性腹泻病毒．喾医群藐袭，孝．1983(07)：9．16．14．孙东波，陈建飞，时洪艳，等．猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析．旁牧兽医学报．2009．40(04)：528．532．15．孙东波，冯力，时洪艳，等．猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展．动物医学勰2006，27(10)：11．14．16．佟有恩，冯力，李伟杰，等．猪流行性腹泻弱毒株的培育．乒目考禽传染痈1998，20(06)：329—332． 华中农业大学2013届硕士学位论文17．佟有恩，冯力，李伟杰，等．猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的碌氕．中国预畴兽医学报．1999。2I(06)：406．410．18．王明，马思奇，周金法，等．猪流行性腹泻灭活疫苗的研究．尹厚言禽传染病．1993(05)：17—19。19．．徐丽丽．猪流行性腹泻病毒重组沙门氏菌的构建及免疫原性分析[硕士学位论文]．华中农业大学，2011．20．宣华，邢德坤，王殿瀛，等．应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究叨．考医7睁学了甄1984，4(3)：202-208．21．张坤，何启盖．猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT．PCR检测方法的建立及临床应用【J】．言我喾医学报．2010，41(8)：1001．1005．22．赵卓．冠状病毒全长cDNA感染性克隆研究进展．国办医学病莓学分掰．2004，11(04)：108-111．23．AlmazanF，GonzalezJM，PenzesZ，eta1．EngineeringthelargestRNAvirusgenomeasaninfectiousbacterialartificialchromosome．ProcNatlAcadSciUSA．2000，97(10)：5516-5521．24．Anonymous．Informationsupplement．VeterinaryRecord．1972，95：49．25．BaeJL，LeeJG，KangTJ，eta1．Inductionofantigen—specificsystemicandmucosalinllTll2neresponsesbyfeedinganimalstransgenicplantsexpressingtheantigen．Vaccine．2003，21(25—26)：4052—4058．26．BaricRS，NelsonGW，FlemingJ0，eta1．InteractionsbetweencoronavirusnucleocapsidproteinandviralRNAs：implicationsforviraltranscription．JVir01．1988，62(11)：4280-4287．27．BaudouxP，CarratC，BesnardeauL，eta1．CoronaviruspseudoparticlesformedwithrecombinantMandEproteinsinducealphainterferonsynthesisbyleukocytes．JVir01．1998，72(11)：8636-8643．28．BemardS，LaudeH．Site—specificalterationoftransmissiblegastroenteritisvirusspikeproteinresultsinmarkedlyreducedpathogenicity．JGenVir01．1995，76(Pt9)：2235．2241．29．BoschBJ，vanderZeeRdeHaanCA，eta1．ThecoronavirusspikeproteinisaclassIvirusfusionprotein：structuralandfunctionalcharacterizationofthefusioncorecomplex．Journalofvirology．2003，77(16)：8801—8811．30．BrianDA，BaricRS．Coronavirusgenomestructureandreplication．CurrTopMicrobiolImmun01．2005，287：1·30．56 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析31．CallebautP，DebouckP，PensaertM．Enzyme-linkedimmunosorbentassayforthedetectionofthecoronavirus·likeagentanditsantibodiesinpigswithporcineepidemicdiarrhea．VetMicrobi01．1982，7(4)：295—306．32．CarvajalA，LanzaI，DiegoR，ela1．EvaluationofablockingELISAusingmonoclonalantibodiesforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirusanditsantibodies．JVetDiagnInvest．1995，7(1)：60·64．33．CasaisR，TIlielV，SiddellSG，eta1．Reversegeneticssystemfortheaviancoronavirusinfectiousbronchitisvirus．JVir01．2001，75(24)：12359—12369．34．ChangSH，BaeJL，KangTJ，eta1．Identificationoftheepitoperegioncapableofinducingneutralizingantibodiesagainsttheporcineepidemicdiarrheavirus．MolCells．2002，14(2)：295—299．35．ChenF，PanY，ZhangX，eta1．CompletegenomesequenceofavariantporcineepidemicdiarrheavirusstrainisolatedinChina．JVir01．2012，86(22)：12448．36．ChenJF，SunDB，WangCB，eta1．MolecularcharacterizationandphylogeneticanalysisofmembraneproteingenesofporcineepidemicdiarrheavirusisolatesinChina．VirusGenes．2008，36(2)：355-364．37．ChenJ，LiuX，ShiD，eta1．Completegenomesequenceofaporcineepidemicdiarrheavirusvariant．JVirot。2012，86(6)：3408．38．ChenJ，WangC，ShiH，eta1．MolecularepidemiologyofporcineepidemicdiarrheavirusinChina．ArchVir01．2010，155(9)：1471—1476．39．ChenJ，WangC，ShiH，eta1．CompletegenomesequenceofaChinesevirulentporcineepidemicdiarrheavirusstrairL，ViroL2011．85(21)：11538-11539．40．ChoiHJ，KimJH，LeeCH，eta1．Antiviralactivityofquercetin7-rhamnosideagainstporcineepidemicdiarrheavirus．AntiviralRes．2009，81(1)：77-81．41．CruzDJ，KimCJ，ShinHJ．TheGPRLQPYmotiflocatedatthecarboxy—terminalofthespikeproteininducesantibodiesthatneutralizePorcineepidemicdiarrheavirus．VirusRes．2008，132(1-2)：192—196．42．deHaanCA，KuoL，MastersPS，eta1．Coronavirusparticleassembly：primarystructurerequirementsofthemembraneproteirLJVir01．1998，72(8)：6838—6850．43．deHaanCA，MastersPS，ShenX，eta1．111egroup—specificmurinecoronavirusgenesarenotessential，buttheirdeletion，byreversegenetics，isaaenuatinginthenaturalhost．Virology．2002，296(1)：177—189．44．DebouckP，PensaertM．Experimentalinfectionofpigswithanewporcineentericcoronavirus，CV777．AmJVe}Res．1980，41(2)：219-223．57 华中农业大学2013届硕士学位论文45．DebouckP，PensaertM，CoussementW．Thepathogenesisofanentericinfectioninpigs，experimentallyinducedbythecoronavirus-likeagent，CV777．VeterinaryMicrobiology．1981，6(2)：157—165．46．DelmasB，GelfiJ，L’HaridonR．AminopeptidaseNisamajorreceptorfortheenteropathogeniccoronavirusTGEV．1992．47．DijkmanR，JebbinkMF，Wilbrir墩B，eta1．Humancoronavirus229EencodesasingleOI强4proteinbetweenthespikeandtheenvelopegenes．VirolJ．2006，3：106．48．EnjuanesL，SolaI，AlmazanF，eta1．Coronavirusderivedexpressionsystems．JBiotechn01．2001，88(3)：183—204．49．EnjuanesL，SolaI，AlmazanF，eta1．Coronavirusderivedexpressionsystems．Progressandproblems．AdvExpMedBi01．2001，494：309-321．50．GonzalezJM，PenzesZ，AlmazanF，eta1．Stabilizationofafull-lengthinfectiouscDNAcloneoftransmissiblegastroenteritiscoronavirusbyinsertionofanintrorrJVir01．2002，76(9)：4655-4661．51．GuscettiF，BemasconiC，ToblerK，eta1．Immunohistochemicaldetectionofporcineepidemicdiarrheaviruscomparedtoothermethods．Cl讯DiagnLabImmun01．1998，5(3)：412-414．52．H画emaBJ，VoidersH，RottierPJ．Live，attenuatedcoronavirusvaccinesthroughthedirecteddeletionofgroup-specificgenesprovideprotectionagainstfelineinfectiousperitonitis．JVir01．2004，78(8)：3863-3871．53．HerreweghAA，VennemaH，HorzinekMC，eta1．nlemoleculargeneticsoffelinecoronaviruses：comparativesequenceanalysisoftheORF7a／7btranscriptionunitofdifferentbiotypes．Virology．1995，212(2)：622-631．54．HofmannM，WylerR．Propagmionofthevirusofporcineepidemicdiarrheaincellculture．，a砌Microbi01．1988，26(11)：2235—2239．55．HofmannM，WylerR．Enzyme-linkedimmunosorbentassayforthedetectionofporcineepidemicdiarrheacoronavirusantibodiesinswinesera．VetMicrobi01．1990，21(3)：263—273．56．HsiehPK，ChangSC，HuangCC，eta1．AssemblyofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirusRNApackagingsignalintovirus-likeparticlesisnucleocapsiddependentJ陆D，．2005，79(22)：13848-13855．57．JackwoodMW，HiltDA，CallisonSA，eta1．Spikeglycoproteincleavagerecognitionsiteanalysisofinfectiousbronchitisvirus．AvianDis．2001，45(2)：366．372．58 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析58．JungK，KangBK，KimJY，eta1．Effectsofepidermalgrowthfactoronatrophicenteritisinpigletsinducedbyexperimentalporcineepidemicdiarrhoeavirus．VetJ．2008，177(2)：231—235．59．KadoiK，SugiokaH，SatohT，eta1．Thepropagationofaporcineepidemicdiarrheavirusinswinecelllines．NewMicrobi01．2002，25(3)：285-290．60．KangTJ，SeoJE，KimDH，eta1．CloningandsequenceanalysisoftheKoreanstrainofspikegeneofporcineepidemicdiarrheavirusandexpressionofitsneutralizingepitopeinplants．ProteinExprP缈扩2005，4l(2)：378-383．61．飚doH，OkumuraY，YamadaH，eta1．Proteasesessentialforhumaninfluenzavirusentryintocellsandtheirinhibitorsaspotentialtherapeuticagents．CurrPharmDes．2007，13(4)：405—414．62．KielianM，ReyFA．Virusmembrane-fusionproteins：morethanonewaytomakeahairpin．NatRevMicrobi01．2006，4(1)：67-76．63．KimO，ChaeC．Comparisonofreversetranscriptionpolymerasechainreaction，immunohistochemistry，andinsituhybridizationforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirusinpigs．CanJVetRes．2002，66(2)：112一ll6．64．KimO，ChaeC．Experimentalinfectionofpigletswithakoreanstrainofporcineepidemicdiarrhoeavirus．JCompPath01．2003，129(1)：55-60．65．KocherhansR，BridgenA，AckermannM，eta1．Completionoftheporcineepidemicdiarrhoeacoronavirus(PEDV)genomesequence．VirusGenes．2001，23(2)：137—144．66．KuoL，MastersPS．Evolvedvariantsofthemembraneproteincanpartiallyreplacetheenvelopeproteininmurinecoronavirusassembly．JVir01．2010，84(24)：12872．12885．67．KweonCH，KwonBJ，LeeJG，eta1．Derivationofaaenuatedporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)asvaccinecandidate．Vaccine．1999，17(20—21)：2546—2553．68．KweonCH，KwonBJ，WooSR，eta1．Immunoprophy7lacticeffectofchickeneggyolkimmunoglobulin(IgY)againstporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)inpiglets．JVetMedSci．2000，62(9)：961-964．69．LaiCJ，ZhaoBT，HoriH，eta1．InfectiousRNAtranscribedfromstablyclonedfull-lengthcDNAofdenguetype4virus．ProcNatlAcadSciUSA．1991，88(12)：5139．5143．70．LaiM，CavanaghD．Themolecularbiologyofcoronaviruses．Advancesinvirusresearch．1997．48：1．100．59 华中农业大学2013届硕士学位论文71．LaudeH，GelfiJ，LavenantL，eta1．SingleaminoacidchangesintheviralglycoproteinMaffectinductionofalphainterferonbythecoronavirustransmissiblegastroenteritisvirus．JVir01．1992，66(2)：743—749．72．LeeC，CalvertJG，WelchSK，eta1．ADNA-launchedreversegeneticssystemforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusrevealsthathomodimerizationofthenucleocapsidproteinisessentialforvirusinfectivity．Virology．2005，331(1)：47．62．73．LeeC，CalvertJG，WelchSW，eta1．ADNA-launchedreversegeneticssystemforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusrevealsthathomodimerizationofthenucleocapsidproteinisessentialforvirusinfectivity．Virology．2005，331(1)：47．62．74．LeeC，ParkCK，LyooYS，eta1．GeneticdifferentiationofthenucleocapsidproteinofKoreanisolatesofporcineepidemicdiarrhoeavirusbyRT-PCRbasedrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis．玩f，2008，178(1)：138-140．75．LeeD，ChaS，LeeC．TheN-terminalregionoftheporcineepidemicdiarrheavirusspikeproteinisimportantforthereceptorbindingKoreanJournalofMicrobiologyandBiotechnology．2011，39：140-145．76．LeeHK，YeoSG．CloningandsequenceanalysisofthenucleocapsidgeneofporcineepidemicdiarrheavirusChinju99．VirusGenes．2003，26(2)：207-212．77．“BX，GeJW，LiYJ．PorcineaminopeptidaseNisafunctionalreceptorforthePEDVcoronavirus．Virology．2007，365(1)：166-172．‘78．LiW，“H，LiuY，eta1．Newvariantsofporcineepidemicdiarrheavirus，China,2011．EmergInfectD西．2012，18(8)：1350—1353．79．LiZL，ZhuL，MaJY，eta1．Molecularcharacterizationandphylogeneticanalysisofporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)fieldstrainsinsouthChina．VirusGenes．2012，45(1)：181—185．80．LissenbergA，VrolOkMM，vanVlietAL，eta1．Luxuryatacost?Recombinantmousehepatitisvirusesexpressingtheaccessoryhemagglutininesteraseproteindisplayreducedfitnessinvitro．JVir01．2005，79(24)：15054-15063．81．MastersPS．rnlemolecularbiologyofcoronaviruses．AdvHrusRes．2006．66：193．292．82．MolenkampR，GreveS，SpaanWJ，eta1．EfficienthomologousRNArecombinationandrequirementforanopenreadingframedudngreplicationofequinearteritisvirusdefectiveinterferingRNAs．JVir01．2000，74(19)：9062-9070． 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析83．NarayananK，ChenCJ，MaedaJ，eta1．Nucleocapsid—independentspecificviralRNApackagingviaviralenvelopeproteinandviralRNAsignal．JVir01．2003．77(5)：2922-2927．84．NarayananK，MaedaA，MaedaJ，eta1．CharacterizationofthecoronavirusMproteinandnuc!eocapsidinteractionininfectedcells．Jyir01．2000，74(17)：8127．8134．85．OhJS，SongDS，YangJS，eta1．Comparisonofanenzyme—linkedimmunosorbentassay、析tllserumneutralizationtestforserodiagnosisofporcineepidemicdiarrheavirusinfectiorLJVetSci．2005，6(4)：349—352．86．OrtegoJ，SolaI，AlmazanF，eta1．Transmissiblegastroenteritiscoronavirusgene7isnotessentialbutinfluencesinvivovirusreplicationandvirulence．Hrology．2003，308(1)：13-22．87．ParkJE，CruzDJ，ShinHJ．Receptor—boundporcineepidemicdiarrheavirusspikeproteincleavedbytrypsininducesmembranefusion．Arch附DZ．2011，156(10)：1749．1756．88．ParkSJ，MoonHJ，YangJS，eta1．SequenceanalysisofthepartialspikeglycoproteingeneofporcineepidemicdiarrheavirusesisolatedinKorea．HrusGenes．2007，35(2)：321—332．89．ParkS，MoonH，LuoY，eta1．CloningandfurthersequenceanalysisoftheORF3geneofwild-andattenuated—typeporcineepidemicdiarrheaviruses．Hrusgenes．2008，36(1)：95—104．90．ParkS，SongD，HaG，eta1．CloningandfurthersequenceanalysisofthespikegeneofattenuatedporcineepidemicdiarrheavirusDRl3．Virusgenes．2007，35(1)：55—64．91．PensaertMB，deBouckP．Anewcoronavirus-likeparticleassociated埘thdiarrheainswine．ArchHr01．1978，58(3)：243-247．92．PyoHM，KimIJ，KimSH，eta1．Escherichiacoliexpressingsingle—chainFvonthecellsurfaceasapotentialprophy7lacticofporcineepidemicdiarrheavirus．Vaccine．2009，27(14)：2030—2036．93．RenX，LiP．Developmentofreversetranscriptionloop—mediatedisothermalamplificationforrapiddetectionofporcineepidemicdiarrheavirus．HrusGenes．2011，42(2)：229-235．94．RenX，SuoS，JangY．DevelopmentofaporcineepidemicdiarrheavirusMprotein—basedELISAforvirusdetection．Biotechnologyletters．2011，33(2)：215．220．61 华中农业大学2013届硕士学位论文95．RiceCM，GrakouiA，GallerReta1．TranscriptionofinfectiousyellowfeverRNAfromfull-lengthcDNAtemplatesproducedbyinvitroligation．砀eNewBiologist．1989，1(3)：285．96．SaifLJ．Coronavirusimmunogens．VetMicrobi01．1993，37(3—4)：285-297．97．SatoT，TakeyamaN，KatsumataA，eta1．Mutationsinthespikegeneofporcineepidemicdiarrheavirusassociated、析tllgrowthadaptationinvitroandattenuationofvirulenceinvivo．VirusGenes．2011，43(1)：72-78．98．SchwarzB，RoutledgeE，SiddellSG．Murinecoronavirusnonstructuralproteinns2isnotessentialforvirusreplicationintransformedcells．JVir01．1990，64(10)：4784．4791．99．ShiratoK，MatsuyamaS，ujikeM，eta1．Roleofproteasesinthereleaseofporcineepidemicdiarrheavirusfrominfectedcells．JVir01．2011，85(15)：7872—7880．100．SongDS，KangBK，OhJS，eta1．Multiplexreversetranscription·PCRforrapiddifferentialdetectionofporcineepidemicdiarrheavirus，transmissiblegastroenteritisvirus，andporcinegroupArotavirus．JVetDiagnlnvest．2006，18(3)：278—281．101．SongDS，OhJS，KangBK，eta1．OralefficacyofVerocellattenuatedporcineepidemicdiarrheavirusDRl3strain．ResVetSci．2007，82(1)：134-140．102．SongDS，YangJS，OhJS，eta1．DifferentiationofaVerocelladaptedporcineepidemicdiarrheavirusfromKoreanfieldstrainsbyrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisofORF3．Vaccine．2003，21(17-18)：1833—1842．103．SongD，ParkB．Porcineepidemicdiarrhoeavirus：acomprehensivereviewofmolecularepidemiology，diagnosis，andvaccines．‘VirusGenes．2012，44(2)：167-175．．104．SriburiRKeelapangP，DuangchindaT，eta1．Constructionofinfectiousdengue2viruscDNAclonesusinghighcopynumberplasmid．JVirolMethods．2001，92(1)：71．82．105．SumiyoshiH，HokeCH，TrentDW．InfectiousJapaneseencephalitisvirusRNACanbesynthesizedfrominvitro—ligatedeDNAtemplates．Journalofvirology。1992，66(9)：5425-5431．106．SunD，FengL，ShiH，eta1．IdentificationoftwonovelBcellepitopesonporcineepidemicdiarrheavirusspikeproteil=LVetMicrobi01．2008，131(1—2)：73-81．107．SunD，ShiH，ChenJ，eta1．GenermionofamousescFvlibraryspecificforporcineaminopeptidaseNusingtheT7phagedisplaysystem．JVirolMethods．2012，182(1-21：99．103．62 猪流行性腹泻g目毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析108．SunRQ，CaiRJ，ChenYQ，eta1．Outbreakofporcineepidemicdiarrheainsucklingpiglets，China．EmergInfectD括．2012，18(1)：161-163．109．TaharaSM，DietlinTA，BergmannCC，eta1．Coronavirustranslationalregulation：leaderaffectsmRNAefficiency．Virology．1994，202(2)：621-630．10．TaniguchiT，PalmieriM，WeissmannC．QBDNA-containinghybridplasmidsgivingrisetoQBphageformationinthebacterialhost．Nature．1978，274(5668)：223．11．ThielV，HeroldJ，ScheUeB，eta1．InfectiousRNAtranscribedinvitrofromaeDNAcopyofthehumancoronavirusgenomeclonedinvacciniavirus．JGenHr01．2001，82(6)：1273-1281．12．ThielV，RashtchianA，HeroldJ，eta1．Effectiveamplificationof20-kbDNAbyreversetranscriptionPCR．AnalBiochem．1997，252(1)：62—70．13．TruongHM，LuZ，KutishGF，eta1．AhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusgeneratedfromaninfectiouseDNAcloneretainstheinvivovirulenceandtransmissibilitypropertiesoftheparentalvirus．Virology．2004，325(2)：308·319．14．VanNieuwstadtAP，ZetstraT．Useoftwoenzyme—linkedimmunosorbentassaystomonitorantibodyresponsesinswinewithexperimentallyinducedinfectionwithporcineepidemicdiarrheavirus．AmJVetRes．1991，52(7)：1044—1050．15．VennemaH，deGrootRJ，HarbourDA，eta1．Primarystructureofthemembraneandnucleocapsidproteingenesoffelineinfectiousperitonitisvirusandimmunogenicityofrecombinantvacciniavirusesinkittens．Virology．1991，181(1)：327．335．16．WakitaT，PietschmannT，KatoT，eta1．ProductionofinfectioushepatitisCvirusintissueculturefromaclonedviralgenome．NatMed．2005，11(7)：791—796．17．WangK，LuW，ChenJ，eta1．PEDVORF3encodesanionchannelproteinandregulatesvirusproductiorLFEBSLett．2012，586(4)：384—391．18．WeissenhomW，HinzA，GaudinY．Virusmembranefusion．FEBSletters．2007，581(11)：2150—2155．19．WoodEN．Anapparentlyllewsyndromeofporcineepidemicdiarrhoea．VetRec．1977，100(12)：243-244．120．WoodsRD．EfficacyofatransmissiblegastroenteritiscoronaviruswithanalteredORF-3gene．CanJVetRes．2001，65(1)：28-32．63 华中农业大学2013届硕士学位论文121．XuX，ZhangH，ZhangQ，eta1．PorcineepidemicdiarrheavirusEproteincausesendoplasmicreticulumstressandup--regulatesinterleukin·-8expression．Virologyjournal．2013，10(1)：26．122．YangX，HuoJ，ChenL，eta1．GeneticvariationanalysisofreemergingporcineepidemicdiarrheavirusprevailingincentralChinafrom2010to2011．Virusgenes．2012：1-8．123．YounS，LeibowitzJL，CollissonEW．Invitroassembled，recombinantinfectiOUSbronchitisvirusesdemonstratethatthe5aopenreadingframeisnotessentialforreplication．Hrology．2005，332(1)：206·215．124．YountB，CurtisKM，BaricRS．StrategyforsystematicassemblyoflargeRNAandDNAgenomes：transmissiblegastroenteritisvirusmodel．Jp静DZ．2000，74(22)：10600．10611．125．YountB，CurtisKM，FritzEA，eta1．Reversegenetics诵mafull—lengthinfectiouscDNAofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus．ProcNatlAcadSciUS么．2003，100(22)：12995—13000．126．YountB，DenisonMR，WeissSReta1．Systematicassemblyofafull-lengthinfectiouscDNAofmousehepatitisvirusstrainA59．JVir01．2002，76(21)：11065．11078．127．YunSI，KimSY，RiceCM，eta1．DevelopmentandapplicationofareversegeneticssystemforJapaneseencephalitisvirus．J跚D，．2003，77(11)：6450-6465．128．ZengR，YangRF，ShiMD，eta1．Characterizationofthe3aproteinofSARS．associatedcoronavirusininfectedveroE6cellsandSARSpatients．JMolBi01．2004，341(1)：271—279．129．ZhangF，HuangQ，MaW，eta1．Amplificationandcloningofthefull-lengthgenomeofJapaneseencephalitisvirusbyanovellongRT—PCRprotocolinacosmidvector．JHrolMethods．2001，96(2)：171—182．130．ZibertA，MaassG，StrebelK，eta1．Infectiousfoot．and．mouthdiseasevirusderivedfromaclonedfull-lengthcDNA．JVir01．1990，64(6)：2467-2473．131．ZunigaS，CruzJL，SolaI，eta1．Coronavirusnucleocapsidproteinfacilitatestemplateswitchingandisrequiredforefficienttranscription．JVir01．2010，84(4)：2169．2】75． 猪流行性腹泻弱毒疫苗毒株的全基因组克隆及序列分析致谢时光如梭，岁月如歌，三年的研究生时光在不经意问已经从指缝溜走。在论文即将完成之际，请首先允许我衷心地向我敬爱的导师何启盖教授表达我的感谢之情。在课题的设计、试验的过程以及论文的撰写和修改方面无处不凝集着导师的心血；三年来，导师在学习、科研及为人处世方面给予我的谆谆教诲让我受益匪浅；在生活方面无微不至的关怀给了我巨大的鼓励与支持；导师渊博的知识、对科研的一丝不苟的精神和儒雅的学者风范都是我终身学习的楷模。感谢陈焕春院士、金梅林教授、付振芳教授，郭爱珍教授、吴斌教授、周锐教授、曹胜波教授、方六荣教授、刘正飞教授、钱平教授、肖少波教授以及张安定副教授、贝为成副教授、蔡旭旺副教授、李祥敏副教授、宋云峰副教授、徐晓娟副教授、江云波副教授和本实验室的陈品老师、孟宪荣老师等在这三年来给我的帮助和支持，在此向他们表示衷心的感谢。感谢本实验室邹浩勇、汪洋、刘英玉、李文涛、程爽、胡翰、邓凤、余腾等博士；柴伟东、宋飞、徐丽丽、马丰英、王雷、肖文、刘淑清、库旭钢、刘羽茜、凌泽熹、张灏、李庆、杨昆、李衡、刘冲、张恒玲、王志成、刘云波、武刚、李娜娜、冷章明、顾玮、李冬冬、叶十一、陈芳洲、吴奇英、王玄珂、万胜锋、郭效珍、李中华、闰贵伟、张佳思、丁振江和陈淑华等硕士研究生以及武汉科前生物制品有限公司的严伟东、张平、刘晓丽、赵洪翠等工作人员，感谢他们在试验中给予我的指导、支持和帮助。感谢所有农业微生物学国家重点实验室的老师和同学，感谢动科动医学院的各位领导和老师，感谢华中农业大学研究生处的领导，也感谢所有帮助过我的老师和同学。最后，我要特别感谢我的父母的养育之恩以及我的哥哥和姐姐，感谢他们在我成长过程中给予我的关爱和支持，他们不管在什么时候都是我坚强的后盾。65i娩秀2013年6月于狮子山