西安市麻疹野病毒核蛋白基因序列分析

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1、西安市麻疹野病毒核蛋白基因序列分析司源,李平,侯铁军,孙亚辉,关蓉晖,姬亦昕,王枫【关键词】麻疹【Abstract】AIM:TostudythegenotypeandcharacteristicsofmeaslesvirusfoundinXiancity.METHODS:Measlesvirusesthepharynxseaslespatientsergence.ThetotalRNAthemeaslesvirusbythephenolchloroformextractionmethod.Thenplifiedt

2、he450bpnucleotidesegmentofcarboxylterminalregionofnucleoproteingenebyRTPCR,determinedthesequenceoftheamplifiedsegments,analyzedandparedthesequenceeaslesvirus13samplesofpharynxseaslesvirus.CONCLUSION:H1genotyperemainspredominantstrainofmeaslesviruscirculatingi

3、nXiancity,easlesviruscirculatinginChina.【Keyeaslesvirus;nucleoproteingene;sequencinganalysis;RTPCR【摘要】目的:研究西安市流行麻疹病毒的基因型别及特征.方法:采集3d内出疹麻疹患者咽拭子标本分离病毒，提取病毒RNA，逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增病毒的核蛋白N基因碳末端的450bp的核苷酸片段，对扩增产物进行序列测定和比较分析.结果:采集咽拭子标本13份，分离出麻疹病毒8株，分离率62%；8株麻疹病毒均为H1基

4、因型.结论:H1基因型麻疹病毒是西安市麻疹病毒的优势流行株，与全国麻疹病毒流行株无明显差异.【关键词】麻疹病毒；核蛋白基因；序列分析；RTPCR0引言麻疹病毒只有一个血清型，但近年来国内外通过对麻疹病毒的基因分析，已发现有8个基因组（A～H），共20个基因型在人类中流行或曾经流行.在麻疹病毒的结构基因中，核蛋白（N）基因和血凝素（H）基因是变异最大的基因，而N基因碳末端450个核苷酸为该基因最大变异区.世界卫生组织（EM培养液中，-20℃冻存.1.2方法1.2.1病毒分离标本接种在EtsteinBarr（EB）病

5、毒转化的狨猴淋巴母细胞（B95a）上，吸附1h后弃上清，换含20mL/L小牛血清RPMI1640培养液8mL，培养14d，每天观察细胞液pH值和细胞病变（CPE），必要时换液或盲传1代，当CPE≥75％时收冻.用兔抗麻疹免疫血清对分离株作中和鉴定.1.2.2RNA提取和逆转录聚合酶链反应（RTPCR）用酚氯仿抽提法提取病毒悬液中的RNA〔1-3〕.参照H1基因型和Edmonston株的序列设计引物，上游引物为601（序列为5＇GCATATTTTAGATTAGG3＇）,下游引物为631（序列为5＇GGCGGCCTT

6、TTGCACCTAGT3＇）.601和631引物分别位于N基因起始编码1079～1096和1576～1595处.用于扩增N基因碳末端的516个核苷酸（bp）片段.在逆转录酶的作用下，用下游引物631于PCR仪上42℃45min，95℃5min，合成cDNA.用601，631引物和PCR试剂盒进行PCR扩增，首先高温启动95℃1min,然后进行30个循环的扩增：95℃45s，50℃45s，72℃1min；最后72℃延伸10min.每次实验设去离子水为阴性对照，扩增后的产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，用QIAqu

7、ickPCRpurificationkit试剂盒纯化扩增产物.1.2.3序列测定使用601引物和BigDyeTMTerminatorV3.0CycleSequencingReadyReactionKit试剂盒进行标记反应，标记反应如下：90℃10s，50℃5s，70℃4min，共25个循环，最后70℃10min延伸.标记后的产物在CENTRISEPCOLUMNS试剂盒再一次纯化，去除多余非特异性荧光.纯化后的产物在ABI377测序仪上，经50g/L聚丙烯酰胺、8.3mol/L尿素凝胶电泳，自动完成序列测定和校对分

8、析〔4-6〕.1.2.4序列分析调出GeneBank里的20个基因型代表株，用BioEdit软件对这些参考株和我们分离的8个毒株N基因的450bp序列进行变异对比分析和基因亲缘性分析，做基因亲缘性关系树.2结果2.1麻疹病毒分离和鉴定13份标本中有8份标本在B95a细胞上出现细胞融合病变.经中和试验鉴定，全部为麻疹病毒.麻疹病毒分离率为62%.野毒株标准命名见表1.表18