联合应用ssh和cdna表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因

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1、联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因作者：何天霖吴志勇罗蒙邱江锋　【摘要】目的利用抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)和大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因。方法从SSH构建的大鼠轻度肝纤维化、重度肝纤维化2个差异cDNA文库中挑选1000条上调显著的基因，与正常大鼠4136条基因克隆制作成一张芯片，筛选早期活化的肝星状细胞相关基因。结果获得与HSC早期活化相关的上

2、调基因有202条，下调基因有80条，其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serumandglucocorticoidsensitivekinase,SGK)在正常大鼠基因克隆和2周及8周SSH上调差异基因中均呈上调信号。结论联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效的方法；SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点，参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导。【关键词】肝星状细胞抑制消减杂交cDNA表达谱芯片肝纤维化血清和糖皮质激素调节蛋白激酶Identificationofinitiativeactivati

3、onrelatedgenesofhepaticstellatecellbybiningSSHandcDNAmicroarray【Abstract】ObjectiveToidentifyinitiativeactivatedgenesofhepaticstellatecellinnormalhepatictissues,slightliverfibrosistissuesandsevereliverfibrosistissuesbyusingsuppressionsubtractivehybridization(SSH)andcDNAmicroarray.MethodsInit

4、iativeactivatedgenesofhepaticstellatecelltnormalratsformakingachip.ResultsV反转录酶作用下合成第一链cDNA。在第一链合成反应液中加T4聚合酶，合成双链cDNA。抽提并沉淀cDNA，将沉淀物溶于50μl灭菌水中。双链经RsaⅠ酶切，产生相对较短的平端片段，纯化酶切产物。将tester的cDNA分为两份，分别连接试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头Adapter1和Adapter2，然后与过量的drivercDNA进行杂交；合并两种杂交产物后再与drivercDNA作第二次杂交；然后将杂交产物做2轮选择性P

5、CR扩增，使仅在testercDNA中特异性高表达片段得到特异性扩增。扩增产物与pGEMT载体连接，转化DH5α感受态细菌，在含氨苄青霉素的LB培养板上，37℃培养18h。挑取白色菌落，增菌，以pGEMTeasy载体多克隆位点两端引物进行菌落PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，证明含有插入片段(200～1000bp)后测序。将测得的基因片段序列与GenBank数据库进行同源性比较分析。1.2芯片制作挑取3个文库中的白色克隆并分配克隆号，在5mlLB培养基中37℃振摇培养过夜。然后取1μl培养液作模板，以pGEMT的一对通用引物T7/SP6扩增外源插入片段。PCR扩

6、增条件为94℃30s、55℃30s、65℃30s，30次循环。反应完毕，取4μl产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳，观察有无特异扩增片段。对于有扩增片段的用QIAquickPCRPurificationKit(QIAGEN公司)纯化、真空抽干，最后以0.5g/L的浓度溶于50%的DMSO中，在95℃变性5min后，迅速置冰上，然后各取10μl移入384孔板并用点样仪点布于醛基化修饰的玻璃片。1.3组织来源肝星状细胞原代分离、培养后，用PDGFBB刺激，终浓度为20ng/ml，HSC细胞刺激15min后，胰蛋白酶消化收获细胞。1.4RNA提取和探针制备去除培养液，用PBS缓冲液快

7、速洗一次，离心除去PBS缓冲液，利用TRiZol总RNA提取试剂分离早期活化HSC的总RNA，分光光度计测浓度和纯度，取总RNA5μg在甲醛琼脂糖凝胶中电泳。按照RTLDPCR方法进行探针标记，具体方法为：①第一条链的合成：取0.05～0.1μg总RNA、1μl3'端反转录引物、1μl5'端引物于一离心管中，加蒸馏水补充至5μl，轻轻混匀，离心后置72℃水浴2min，然后置于冰上。再次离心并加入如下组分：2μl5×第一链buffer、1μldNTP、1μlDTT、1μlMMLV反转录酶，混匀并离心，于