caspase┐3融合蛋白基因的构建及其对hela细胞凋亡的诱导作用

《caspase┐3融合蛋白基因的构建及其对hela细胞凋亡的诱导作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、Caspase┐3融合蛋白基因的构建及其对HeLa细胞凋亡的诱导作用　　摘要:目的观察重构型caspase-3及其N-端融合蛋白的表达对HeLa细胞的凋亡诱导作用.方法用反转录PCR获取人caspase-3基因，用重组PCR方法构建人重构型caspase-3及其融合蛋白基因，将基因克隆入表达载体pcDNA3，脂质体法转染HeLa细胞，通过细胞计数、电镜观察、MTT法等检测被转染细胞的生长及其凋亡状况.结果成功获得了cas-pase-3基因，构建了重构型caspase-3基因和重构型caspase-3与绿脓杆菌外毒素（PE）转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因及其表达载体

2、，与对照组相比，在转染后1～4d内，两种基因的表达均导致HeLa细胞存活数减少，大量细胞发生凋亡，且二者活性相当.结论重构型caspase-3及其融合蛋白可以诱导转染的HeLa细胞发生凋亡.　　Keys;genetherapy　　Abstract:AIMToinvestigatetheinductionofHeLacellstoapoptosisbytheexpressionofreversedcaspase-3anditsN-terminalfusionprotein.METHODSRT-PCRandrebi-nantPCRplifyhumancaspase-3g

3、eneandconstructreversedcaspase-3anditsfusionproteingenes.Folloicroscopephotographs，asancaspase-3gene，thegenesandex-pressionvectorsofreversedcaspase-3anditsfusionproteinainofPseudomonasexo-toxinA（PE）.paredilardegreethedecreaseoflivingcellnumbersandmassiveoccurrenceofapoptosis.CONCLUSION

4、Bothreversedcaspase-3anditsfusionpro-teincaneffectivelyinduceHeLacellstoapoptosis.　　0引言　　Caspase，即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinylaspartate-specificprotease），是一类在细胞凋亡中起关键作用的蛋白酶家族［1-3］，而Cas-pase-3更是在凋亡的信息传递中居于核心地位［4-6］.它在细胞中通常以酶原形式存在，包含一个N端原结构域（prodomain），大亚基和小亚基，在外界或自身凋亡因素的刺激下，酶原被切割，其中原结构域被去除，

5、大、小亚基游离并组装成具有活性的caspase-3分子.活化后的caspase-3识别底物蛋白特异的四肽序列（其中第4位氨基酸为天冬氨酸，如IETD），并在天冬氨酸羧基侧切割蛋白质，从而导致多种细胞结构及功能蛋白失活，或促凋亡蛋白活化，使细胞走向凋亡［6，7］.Srinivasula等从活性caspase-3晶体结构中得到启示，将caspase-3大、小亚基基因颠倒，使小亚基位于大亚基前端，构建了一种新型的caspase-3分子（重构型caspase-3），它可以自发折叠成具有活性的三维结构形式，而不需上游分子的切割活化［8，9］.绿脓杆菌外毒素（pseudomon

6、asexotoxinA，PE）是一种毒性极强的细菌外毒素分子，它包含由613个氨基酸构成的3个功能结构域，其中253至364位氨基酸（domainII）被认为与分子的转膜作用相关［10］.本文研究了重构型caspase-3分子在细胞中的表达及活性，并进一步考察了它与PEdomainⅡ部分肽段构建的融合蛋白的促凋亡活性.　　1材料和方法　　1.1材料　　①细胞系:人淋巴瘤Jurkat及人宫颈癌HeLa细胞系分别由本室路凡硕士和刘慧萍博士馈赠;②菌种和质粒:E.coliDH5α菌种、pUC19，pcD-NA3载体均为本室保存;③工具酶及试剂:限制性内切酶、莫罗尼鼠类白血

7、病毒（M-MLV）反转录酶、T4DNA连接酶等购自Promega公司，Taq酶、新生牛血清、RPMI1640，DMEM及脂质体lipofec-tamineTM2000为Gibco公司产品.　　1.2方法　　1.2.1Caspase-3基因的获取及克隆　　培养Jurkat细胞至对数期，收集细胞，细胞数应在5～10×106，用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，设计引物P1，P2（P1:5’-TTTGAATTCATGGAGAACACTGAA-AACTCA-3’;P2:5’-TTTGGATCCTTAGTGA-TAAAAATAGAGTTC-3’），以P2为引物，反转录出c