人截短型凋亡诱导因子对hela细胞的促凋亡作用

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1、人截短型凋亡诱导因子对HeLa细胞的促凋亡作用作者：张巍，张勇，孟艳玲，温伟红，薛茜，任君琳，杨安钢【关键词】凋亡诱导因子；,HeLa细胞；,细胞凋亡　　ProapoptoticactivityoftruncatedhumanapoptosisinducingfactoronHeLacells　　【Abstract】AIM:Toobservetheexpressionoftruncatedhumanapoptosisinducingfactor(AIF)geneanditseffectonHeLacells.METHOD

2、S:AfterAIF△1-120geneanAIFgene(AIF△1-400)inalmitochondriallocalizationsequence(MLS),thecodingsequenceofflavineadeninedinucleotide(FAD)bindingdomainandnicotinamideadeninedinucleotide(NADH)bindingdomainofAIFprotEin．ThetruncatedhumanAIFgene(AIF△1-400)icroscopeanalysi

3、sandMTTtest．RESULTS:TheeukaryoticexpressionvectorcontainingthetruncatedhumanAIF(AIF△1-400)geneicroscope．MTTtestshoanAIF(AIF△1-400)genecaninducetheapoptosisofthetransfectedhumanHeLacells.　　【Keyk的抑制，也不受Bcl2过量表达的影响［1］，代表着独立于caspase信号通路之外的另一条凋亡途径［5］.在成功构建AIF△1-120基因的

4、基础上［6］，我们对AIF基因的结构［7］进行了进一步截短并构建AIF△1-400基因，旨在研究其对HeLa细胞的促凋亡活性.　　1　材料和方法　　1.1材料　　pcDNA3AIF△1-120质粒为第四军医大学免疫学教研室构建，E.coliDH5α菌种、人HeLa细胞系为第四军医大学免疫学教研室保存和培养；载体pcDNA3由第四军医大学免疫学教研室保存；载体pIRES2EGFP（Clontech公司）；TaqDNA聚合酶，DNA限制性核酸内切酶，T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；新生牛血清（杭州四季青生物公司）；RP

5、MI1640及脂质体LipofectAMIM2000（Invitrogen公司）；山羊抗人AIF多克隆抗体（SantaCruz公司）；FITC标记兔抗山羊二抗（中杉公司）.　　1.2方法　　1.2.1引物设计　　根据AIF的基因序列设计引物为zy1（5′TTTGGTACCGAATTCCACCATGGAGCCCAATGTTGAGTTGGCC3′）和zy2（5′TTTTCTAGAGTCGACTCAGTCTTCATGAATGTTGAATAG3′）.　　1.2.2AIF△1-400真核表达载体的构建　　以质粒pcDNA3AIF△

6、1-120为模板，用zy1和zy2进行PCR,扩增出AIF基因400位氨基酸密码子以后的片段.将该基因片段经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后克隆入pcDNA3载体的相应位点，并转化E.coliDH5α菌株，挑克隆，提取质粒，酶切鉴定，鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序，将测序正确的质粒命名为pcDNA3AIF△1-400.同时构建绿色荧光蛋白共表达载体pIRES2EGFPAIF△1-400.　　1.2.3细胞转染于细胞　　转染前24h，用胰酶消化生长至对数期的HeLa细胞，于放置玻片的24孔板中培养，待细胞达80%汇合率时进行

7、转染.细胞爬片先用无血清RPMI1640洗2次，加0.5mL无血清RPMI1640.将1μgpIRES2EGFPAIF△1-400质粒DNA和2μLLipofectAMIM2000分别加于50μL无血清RPMI1640中，轻轻振摇5min，混匀，制成转染液，室温静置20min后，将转染液逐滴加入爬片细胞中，轻轻混合，置37℃孵育6h，弃去转染液，加含100mL/L新生牛血清的RPMI1640.分别于转染后24，48和72h取出玻片，用40g/L多聚甲醛固定5～10min后，于荧光显微镜下观察细胞形态.对照组细胞转染pIR

8、ES2EGFP空载体，处理方法与实验组相同.　　1.2.4间接免疫荧光检测　　将HeLa细胞加至24孔板的玻片上，用脂质体法转染pcDNA3AIF△1-400，同时转染pcDNA3AIF△1-120作为阳性对照，pcDNA3作为阴性对照，于转染后48h取出爬片，用PBS(pH7.4)洗3次，40g/L多聚甲醛固定5～