caspase┐3融合蛋白基因的构建及其对hela细胞凋亡的诱导作用论文

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1、Caspase┐3融合蛋白基因的构建及其对HeLa细胞凋亡的诱导作用论文.freels;genetherapyAbstract:AIMToinvestigatetheinductionofHeLacellstoapoptosisbytheexpressionofreversedcaspase-3anditsN-terminalfusionprotein.METHODSRT-PCRandrebi-nantPCRplifyhumancaspase-3geneandconstructreversedcaspase-3anditsfusionproteingenes.Folloi

2、croscopephotographs，asancaspase-3gene，thegenesandex-pressionvectorsofreversedcaspase-3anditsfusionproteinainofPseudomonasexo-toxinA（PE）.paredilardegreethedecreaseoflivingcellnumbersandmassiveoccurrenceofapoptosis.CONCLUSIONBothreversedcaspase-3anditsfusionpro-teincaneffectivelyinduceHeLac

3、ellstoapoptosis.0引言Caspase，即天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinylaspartate-specificprotease），是一类在细胞凋亡中起关键作用的蛋白酶家族［1-3］，而Cas-pase-3更是在凋亡的信息传递中居于核心地位［4-6］.它在细胞中通常以酶原形式存在，包含一个N端原结构域（prodomain），大亚基和小亚基，在外界或自身凋亡因素的刺激下，酶原被切割，其中原结构域被去除，大、小亚基游离并组装成具有活性的caspase-3分子.活化后的caspase-3识别底物蛋白特异的四肽序列（其中第4位氨基酸为天冬氨酸，如IET

4、D），并在天冬氨酸羧基侧切割蛋白质，从而导致多种细胞结构及功能蛋白失活，或促凋亡蛋白活化，使细胞走向凋亡［6，7］.Srinivasula等从活性caspase-3晶体结构中得到启示，将caspase-3大、小亚基基因颠倒，使小亚基位于大亚基前端，构建了一种新型的caspase-3分子（重构型caspase-3），它可以自发折叠成具有活性的三维结构形式，而不需上游分子的切割活化［8，9］.绿脓杆菌外毒素（pseudomonasexotoxinA，PE）是一种毒性极强的细菌外毒素分子，它包含由613个氨基酸构成的3个功能结构域，其中253至364位氨基酸（domainII）

5、被认为与分子的转膜作用相关［10］.本文研究了重构型caspase-3分子在细胞中的表达及活性，并进一步考察了它与PEdomainⅡ部分肽段构建的融合蛋白的促凋亡活性.1材料和方法1.1材料①细胞系:人淋巴瘤Jurkat及人宫颈癌HeLa细胞系分别由本室路凡硕士和刘慧萍博士馈赠;②菌种和质粒:E.coliDH5α菌种、pUC19，pcD-NA3载体均为本室保存;③工具酶及试剂:限制性内切酶、莫罗尼鼠类白血病毒（M-MLV）反转录酶、T4DNA连接酶等购自Promega公司，Taq酶、新生牛血清、RPMI1640，DMEM及脂质体lipofec-tamineTM2000为G

6、ibco公司产品.1.2方法1.2.1Caspase-3基因的获取及克隆培养Jurkat细胞至对数期，收集细胞，细胞数应在5～10×106，用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，设计引物P1，P2（P1:5’-TTTGAATTCATGGAGAACACTGAA-AACTCA-3’;P2:5’-TTTGGATCCTTAGTGA-TAAAAATAGAGTTC-3’），以P2为引物，反转录出cDNA第一链，用P1，P2为引物，PCR得到cas-pase-3基因，以EcoRI和BamHI双酶切后克隆入pUC19相应位点，转化E.coli，并进行测序.1.2.2Caspase-3基因改

7、建及真核表达载体的构建设计引物，分别扩增caspase-3大、小亚基基因，用重组PCR方法进行连接，使小亚基编码序列位于上游，得到重构型caspase-3编码序列（rc3），进一步用重组PCR方法在5′端连接绿脓杆菌外毒素（PE）253-364氨基酸的编码序列，得到重构型Caspase-3融合蛋白基因（pr3），上述序列以EcoRI/XbaI酶切，克隆入真核表达载体pcDNA3，测序.1.2.3细胞转染、转染后细胞计数及电镜观察转染前24h将HeLa细胞重铺在12个6cm培养皿中，使每皿细胞数在1×106～2×106，待细胞长