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1、冬凌草甲素作用PI3K/AKT通路诱导HeLa细胞凋亡论文沈宏伟，胡红珍，曾海涛，柯佩琪，杨越波，李小毛，任姿【摘要】【目的】研究冬凌草甲素诱导HeLa细胞凋亡的作用及其机制。【方法】MTT法测定冬凌草甲素对HeLa细胞的生长抑制实验,Hoechst33342荧光染色等观察细胞核形态学变化;LDH法研究细胞死亡的途径。流式细胞仪检测细胞的凋亡，免疫印迹实验检测相关蛋白的表达。【结果】25μmol/L以上的冬凌草甲素对宫颈癌HeLa细胞具有明显的生长抑制作用,并能诱导细胞发生凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细胞凋亡
2、率均明显升高,冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中,细胞端粒酶Akt、FKHRL、GSK3表达水平及活性显著降低。【结论】冬凌草甲素能够通过诱导人子宫颈癌HeLa细胞发生凋亡而发挥抑制HeLa细胞生长作用.freelechanismofactionoforidonin,aditerpenoidisolatedfromRabdosiarubescens,inhumancervicalcarcinomaHeLacellline.【Methods】Morphologicalanalysis,nuclearcondensation,an
3、dfragmentationofchromatinonitoredusingHoechst33342staining.Cellviabilityetricassay.Cellapoptosisandapoptosis-relatedproteinsinHeLacelllineetryandI1640培养液于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度的细胞培养箱培养,实验使用细胞均为接种后24h处于对数生长期细胞。1.2诱导细胞凋亡的形态学观察及测量将细胞用2.5g/L胰蛋白酶消化,接种至24孔板中,每孔含细胞数4×104个,每孔0.5mL的完全培养
4、液中,置37℃、体积分数为5%的CO2培养24h,更换新鲜培养基。加冬凌草甲素,使药物终浓度分别为0、10、20mg/L,继续培养48h,加50g/L多聚甲醛(PBS,pH7.2)4mL,固定20min。加入Hoechst33342,使终浓度为5mg/L,室温暗处静置,去上清液,加PBS(pH7.2)洗2次,在多功能倒置显微镜(NikonTE300)下观察,并用LeicaDC200拍照。1.3细胞生长率测定采用MTT法检测HeLa细胞的生长率。取对数生长期细胞,用完全培养液调整细胞数为1×104个/mL,接种于96孔板,24h后分别加入终浓
5、度为:2.5,5.0,10.0,25.0,50.0μmol/L的冬凌草甲素作用24h,同时设置正常对照组(加实验组等体积培养液做对照),每组6复孔，取药物作用24h后,每孔加入5mg/mLMTT10μL,摇床混匀后,继续培养4h,每孔吸出100μL上清液,同时每孔加入DMSO(国产)100μL,摇床混匀15min,室温静置20min后,在酶标仪(波长=495nm/530nm)测A值,计算细胞生长率:细胞生长率=（处理组/正常对照组）×100%。并且采用上述方法检测25.0μmol/L的冬凌草甲素作用0，6，12，24h后HeLa细胞的细胞生
6、长率。1.4流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡率将HeLa细胞数按1×104/mL置于100mL培养瓶中,分对照组和药物组,药物组为25.0μmol/L的冬凌草甲素,分别作用0，6，12，18，24h后用于流式细胞仪检测，每组6复孔。细胞凋亡检测:收集对照组和药物组各20000个细胞，PBS液洗涤,加入碘化丙啶(PI)工作液0.5mL(浓度为10μg/mL)(北京岳泰生物公司),室温避光30min,FACScan流式细胞仪分析和处理数据。1.5A)室温作用4h。漂洗3次后加第二抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体)室温作用2h,漂洗3次。
7、加发光剂(LumiGLO),置感光盒中感光,显影,定影。实验重复3次。1.6统计处理数据用ｘ±ｓ表示,采用统计软件SPSS10.0进行数据处理,组间数据采用t检验或秩和检验。x2结果2.1冬凌草甲素诱导细胞凋亡的形态变化在相差显微镜下,对照组细胞界限清晰,胞浆丰富,饱满;在荧光显微镜下,胞核圆形或椭圆形,染色质均匀分布,少见强荧光的胞核(处于染色体聚集的有丝分裂细胞核呈强蓝荧光)。HeLa细胞被冬凌草甲素处理24h后,凋亡细胞脱落悬浮于孔板底部;冬凌草甲素终浓度5.0μmol/L时,细胞变圆,体积缩小,核呈强荧光的凋亡细胞明显多于对照组;当
8、终浓度25.0μmol/L时,细胞变圆,体积缩小,表面粗糙,胞核缩小,呈强蓝色荧光,可见染色质浓缩呈斑块状,出现凋亡小体,呈典型的凋亡细胞形态(图1)。2.2冬凌草甲素抑制HeL
