冬凌草甲素对hl60细胞凋亡及survivin表达的影响

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1、冬凌草甲素对HL60细胞凋亡及Survivin表达的影响【摘要】目的探讨冬凌草甲素对人白血病细胞株HL60细胞生长抑制作用及其机制。方法收集经不同浓度冬凌草甲素干预的HL60细胞，制成细胞涂片,光学显微镜下观察细胞形态。采用MTT比色法观察不同浓度冬凌草甲素对HL60细胞增殖的抑制作用，通过凋亡试剂盒AnnexinVFITC标记，流式细胞仪检测细胞凋亡率，并以RTPCR检测凋亡抑制基因Survivin的表达。结果冬凌草甲素在10～25μmol/L范围内可抑制HL60细胞的生长，且呈时间和浓度依赖性。并可诱导HL60细胞发生凋亡，表现出特异性的凋亡形态学改变。流式细胞仪分析显示

2、，冬凌草甲素处理后凋亡细胞比例增多,且随着药物浓度的增加而逐渐增加。RTPCR检测结果显示,20μmol/L冬凌草甲素作用后，与对照组相比，HL60细胞SurvivinmRNA水平下降，且随时间延长表现得更为明显。结论冬凌草甲素能抑制人白血病细胞株HL60细胞的生长增殖，并可诱导其发生凋亡，其作用机制可能与凋亡抑制基因Survivin的下调有关。【关键词】L60细胞；冬凌草甲素；细胞凋亡；Survivin【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheantiproliferationeffectofrebescensineAonleukemiaHL60c

3、ellsanditsmechanism.MethodsHL60cellsinculturemediuminvitroears.MTTassayetryinecellapoptosisrate.RTPCRo1/L)couldinhibitthegroeanddosedependentmanner.MarkedmorphologicalchangesofcellapoptosisRNAoreobviouslyol/L.ConclusionRebescensineAcouldinhibitproliferationandinduceapoptosisofHL60cellsinvitro

4、.OneofthemechanismsmaybethedoRNA.【Keyg/支(C≥98%)；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为AMRESCO产品；膜联蛋白V(AnnexinV)凋亡检测试剂盒购于Biovision公司。1.2实验方法1.2.1细胞培养：HL60细胞株复苏后悬浮生长于RPMI1640培养液中，内含10%小牛血清，1mmol/L谷胺酰胺及青、链霉素各100U/L。于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养，每2～3d传代1次，取对数生长期的细胞接种于含冬凌草甲素浓度分别为5、10、15、20、25μmol/L的培养体系中进行实验,将细胞终浓度调至2×105/L。1.2.2细胞形态学

5、观察：收集经不同浓度的冬凌草甲素分别诱导处理24、48和72h的HL60细胞，离心洗涤，制成细胞涂片,干燥后瑞氏姬姆萨染色,光学显微镜下观察细胞形态。观察细胞处理后细胞膜细胞质及细胞核的变化，尤其观察凋亡小体形成等。1.2.3MTT比色法检测细胞增殖抑制率:调取HL60细胞1.0×105/ml，接种于96孔培养板内，每孔100μl，每组各设6个复孔，同时设调零孔（空白，培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。每组设定3复孔。加入冬凌草甲素使终浓度分别为5、10、15、20、25μmol/L。置37℃、5%CO2温箱培养，分别诱

6、导培养至24、48和72h，于终止培养前4h每孔加MTT（5mg/ml）10μl，继续孵育4h。终止培养后,离心，吸去上清，每孔加150μl二甲基亚砜（DMSO），摇匀，置摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上波长490nm处测各孔吸光值。用空白对照调零,计算出药物对细胞生长抑制率。根据公式细胞抑制率＝1-（试验组OD值－空白组OD值）/（对照组OD值－空白孔OD值）×100%=(对照组值-实验组值)/对照组值×100%，分别求得各组的细胞抑制率。1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率：收集不同浓度冬凌草甲素作用72h后的HL60细胞，分别制备成0.5mlPBS单细胞悬

7、液,先后加入凋亡试剂盒中AnnexinVFITC和PI各5μl,室温下避光染色10min,上流式细胞仪检测,软件分析结果，未加药组为对照组。1.2.5RTPCR检测SurvivinmRNA的表达:收集对照组和药物作用组（冬凌草甲素20μmol/L作用48h）细胞，Trizol裂解（GIBCO公司）提取细胞总RNA，特定蛋白分析仪测定RNA纯度（A260/A280＞1.75）。加入随机引物及MMuLV逆转录酶（MBI