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时间:2018-05-02
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1、冬凌草甲素对HL60细胞凋亡及Survivin表达的影响【摘要】目的探讨冬凌草甲素对人白血病细胞株HL60细胞生长抑制作用及其机制。方法收集经不同浓度冬凌草甲素干预的HL60细胞,制成细胞涂片,光学显微镜下观察细胞形态。采用MTT比色法观察不同浓度冬凌草甲素对HL60细胞增殖的抑制作用,通过凋亡试剂盒AnnexinVFITC标记,流式细胞仪检测细胞凋亡率,并以RTPCR检测凋亡抑制基因Survivin的表达。结果冬凌草甲素在10~25μmol/L范围内可抑制HL60细胞的生长,且呈时间和浓度依赖性。并可诱导HL60细胞发生凋亡,表现出特异性的凋亡形态学改变。流式细胞仪分析显示
2、,冬凌草甲素处理后凋亡细胞比例增多,且随着药物浓度的增加而逐渐增加。RTPCR检测结果显示,20μmol/L冬凌草甲素作用后,与对照组相比,HL60细胞SurvivinmRNA水平下降,且随时间延长表现得更为明显。结论冬凌草甲素能抑制人白血病细胞株HL60细胞的生长增殖,并可诱导其发生凋亡,其作用机制可能与凋亡抑制基因Survivin的下调有关。【关键词】L60细胞;冬凌草甲素;细胞凋亡;Survivin【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheantiproliferationeffectofrebescensineAonleukemiaHL60c
3、ellsanditsmechanism.MethodsHL60cellsinculturemediuminvitroears.MTTassayetryinecellapoptosisrate.RTPCRo1/L)couldinhibitthegroeanddosedependentmanner.MarkedmorphologicalchangesofcellapoptosisRNAoreobviouslyol/L.ConclusionRebescensineAcouldinhibitproliferationandinduceapoptosisofHL60cellsinvitro
4、.OneofthemechanismsmaybethedoRNA.【Keyg/支(C≥98%);四甲基偶氮唑蓝(MTT)为AMRESCO产品;膜联蛋白V(AnnexinV)凋亡检测试剂盒购于Biovision公司。1.2实验方法1.2.1细胞培养:HL60细胞株复苏后悬浮生长于RPMI1640培养液中,内含10%小牛血清,1mmol/L谷胺酰胺及青、链霉素各100U/L。于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养,每2~3d传代1次,取对数生长期的细胞接种于含冬凌草甲素浓度分别为5、10、15、20、25μmol/L的培养体系中进行实验,将细胞终浓度调至2×105/L。1.2.2细胞形态学
5、观察:收集经不同浓度的冬凌草甲素分别诱导处理24、48和72h的HL60细胞,离心洗涤,制成细胞涂片,干燥后瑞氏姬姆萨染色,光学显微镜下观察细胞形态。观察细胞处理后细胞膜细胞质及细胞核的变化,尤其观察凋亡小体形成等。1.2.3MTT比色法检测细胞增殖抑制率:调取HL60细胞1.0×105/ml,接种于96孔培养板内,每孔100μl,每组各设6个复孔,同时设调零孔(空白,培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。每组设定3复孔。加入冬凌草甲素使终浓度分别为5、10、15、20、25μmol/L。置37℃、5%CO2温箱培养,分别诱
6、导培养至24、48和72h,于终止培养前4h每孔加MTT(5mg/ml)10μl,继续孵育4h。终止培养后,离心,吸去上清,每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO),摇匀,置摇床上低速振荡10min,使结晶充分溶解,在酶联免疫检测仪上波长490nm处测各孔吸光值。用空白对照调零,计算出药物对细胞生长抑制率。根据公式细胞抑制率=1-(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%=(对照组值-实验组值)/对照组值×100%,分别求得各组的细胞抑制率。1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率:收集不同浓度冬凌草甲素作用72h后的HL60细胞,分别制备成0.5mlPBS单细胞悬
7、液,先后加入凋亡试剂盒中AnnexinVFITC和PI各5μl,室温下避光染色10min,上流式细胞仪检测,软件分析结果,未加药组为对照组。1.2.5RTPCR检测SurvivinmRNA的表达:收集对照组和药物作用组(冬凌草甲素20μmol/L作用48h)细胞,Trizol裂解(GIBCO公司)提取细胞总RNA,特定蛋白分析仪测定RNA纯度(A260/A280>1.75)。加入随机引物及MMuLV逆转录酶(MBI
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