反义抑制survivin表达对槲皮素诱导肝癌ssmc7721细胞凋亡的影响

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1、反义抑制Survivin表达对槲皮素诱导肝癌SSMC7721细胞凋亡的影响：李安强,郭天康,李荣范,顾远晖,蔡辉【摘要】目的：采用Survivin反义寡核苷酸(ASODN)复合物抑制survivin的表达，研究其对槲皮素诱导肝癌SSMC7721细胞凋亡的影响.方法：体外培养人肝癌SSMC7721细胞，取对数生长期细胞进行实验.实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400μmol/LSODN复合物组、400μmol/LASODN复合物组(设平行组)，转染48h;Ⅱ弃掉Ⅰ部分各组培养液，换新指定培养液，分为空白对照组

2、、40μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+40μmol/L槲皮素组(联合组)，孵育细胞24h后检测.Ⅰ结束时采用RTPCR、细胞免疫组化染色检测各组SSMC7721细胞survivin表达变化；Ⅱ结束时用吖啶橙染色法观察细胞凋亡时形态变化，MTT法检测SSMC7721细胞生长抑制率，AnnexiV/PI双染流式细胞仪检测SSMC7721细胞凋亡率.结果：ASODN复合物作用肝癌SSMC7721细胞48h后能下调survivinmRNA及Survivin蛋白的表达(P<0.01)；

3、与其他组比较，联合组AO染色图片可观察到凋亡小体等典型的细胞凋亡形态特征变化且凋亡细胞数量明显增多，并用MTT法、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测显示联合组细胞的生长抑制率增高(P<0.01)、细胞凋亡率提高(P<0.01).结论:ASODN复合物可有效抑制肝癌SSMC7721细胞survivin基因的表达；ASODN复合物能增强槲皮素对SSMC7721细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用即二者具有协同作用，该作用可能与抑制survivin基因的表达有关.【关键词】反义寡核苷酸；槲皮素；肝肿瘤；细胞凋亡；细胞周期；Survivin0引言肝癌(hepaticcarcin

4、oma,HCC)是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，对于大多数肝癌患者，经肝动脉化学药物栓塞治疗和全身化疗仍是最常用的治疗方法.近年来抗凋亡机制在肿瘤细胞耐药性发生中的作用倍受关注［1］.survivin是1997年由Ambrosini等［2］发现，Ito等［3］报道Survivin蛋白对破坏肝癌细胞增生凋亡平衡、促进肝癌细胞快速增生具有重要作用.槲皮素(quercetin,Quc)是广泛分布于蔬菜、水果、中草药等的一种天然的黄酮类化合物，化学名为3,3′,4′,5,7五羟基黄酮.LopezLazaro等［4］研究表明，Quc没有毒副作用.近年来的研究表明Quc在体外、动物实验模

5、型中均显示出抗癌活性［4-6］.本实验旨在研究反义抑制survivin的表达，检测其对Quc抑制肝癌SSMC7721生长和诱导细胞凋亡的影响，探讨反义抑制survivin的表达是否在体外可增强Quc抗癌作用及可能的机制，为其进一步动物实验和临床应用提供新的实验依据.1材料和方法1.1材料人肝癌细胞株SSMC7721兰州大学医学实验中心提供.RPMI1640(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季清公司)，槲皮素(Sigma公司,用前以少量DMSO溶解，用时加RPMI1640稀释至使用浓度)，MTT(Sigma公司),Trizol(BBI公司)，Survivin蛋白一抗兔抗人抗体、

6、二抗羊抗兔抗体(北京中山公司)，TaKaRa试剂盒(宝生物工程公司)，AnnexiV/PI试剂盒(宝灵试剂公司),阳离子脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司).寡核苷酸(ODNs)脂质体(Lip)转染复合物survivin正、反义寡核苷酸的设计、合成：根据survivin的基因序列(GenBankAccessionNumberU75285),应用Primer5.0软件设计互补于survivinmRNA的232-251序列的20个碱基组成的ASODN链：5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′,同时合成正义链：5′CGCAGTAGCTGCGC

7、TGATTG3′,两条链均采用硫代磷酸化修饰.在GenBank中证实反义寡核苷酸(ASODN)及正义寡核苷酸(SODN)与任何已知哺乳动物基因无匹配，上海生工公司合成.用LipofectamineTM2000输送ODNs，依文献［7］ODNs/LipoTM2000=4g/L配置ODNsLipoTM2000转染复合物，按质脂体转染试剂盒说明书进行操作.1.2方法取对数生长期的SSMC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔或6孔培养板或1