针对caspase3基因的rna抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用

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1、针对caspase3基因的RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用作者：焦成国陈加俊宋冬晶刘斌黄燕苹【摘要】　　目的探讨针对caspase3基因的RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用。方法NGF诱导PC12细胞为类神经细胞。细胞随机分为对照组、模型组、GFPsiRNA组、caspase3siRNA组。对照组用完全培养液培养，其他3组细胞用6羟基多巴胺制作帕金森病细胞模型。于制作模型前24h进行转染。造模后对caspase3及细胞凋亡率等指标进行检测。结果（1）凋亡率：模型组细胞凋亡率〔（65.36±10.10）%〕明显高于对照组〔（5.00±1.00

2、）%〕，有显著性差异(Ｐ<0.01)；caspase3siRNA组〔(19.00±4.08)％〕明显低于模型组(Ｐ<0.01)。（2）caspase3阳性率:模型组的caspase3阳性率〔(30.15±7.02)％〕明显高于对照组〔(8.20±2.45)％〕，差异有统计学意义(P<0.01)；caspase3siRNA组caspase3阳性率〔(12.00±2.90)％〕明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。结论针对caspase3的siRNA能有效地抑制帕金森病细胞凋亡，对6羟基多巴胺毒性作用下的神经细

3、胞损伤有一定的保护作用。【关键词】帕金森病；RNA干扰；细胞凋亡　　近年来研究表明，细胞凋亡在帕金森病的病理机制中起重要作用。细胞凋亡涉及多种基因的复杂变化，其中凋亡促进基因caspase3与之关系密切〔1，2〕。基因干预可通过降低凋亡基因的表达而对细胞凋亡起到干预作用。本实验用6羟基多巴胺作用于NGF诱导后的PC12细胞，建立帕金森病细胞模型，用RNA干扰(RNAi)方法对Fas基因表达进行抑制，从而观察该方法对帕金森病细胞凋亡的影响。　　1材料与方法　　1.1细胞培养和诱导　　PC12细胞于完全培养液（RPMI1640＋15％新生牛血清＋青霉素）中

4、培养，每3d换液1次，5～6d传代1次。取对数生长期PC12细胞，消化、离心后用完全培养基重悬，密度为105/ml，待80％汇合时吸去旧的培养液，加入新培养液备用。成熟的PC12细胞接种于含有50ng/ml（约2nmol/L）NGF的完全DMEM培养液中，使细胞密度达到2.5×104～10×104/cm3，每2～3d换液1次。约1l，待80％汇合时吸去旧的培养液，加入新培养液备用。将模型组、GFPsiRNA组、caspase3siRNA组细胞接种于162cm2组织培养板中，待细胞贴壁成单层后，去上清，加入6羟基多巴胺培养24h后进行caspase3表

5、达及细胞凋亡相关检测。　　1.4caspase3siRNA序列　　caspase3正义链：5′GATCCCGTACCACTTGACATTATCGTTCTTGATATCCGGAACGATAATGTCAAGTGGTATTTTTTCCAAA3′,反义链：5′AGCTTTTGGAAAAAATACCACTTGACATTATCGTTCTCTCTTGAAGAACGATAATGTCAAGTGGTACGG3′（试剂购自大连宝生物公司）。　　1.5TUNEL法检测细胞凋亡　　脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法（TUNEL）用细胞凋亡试剂盒(罗氏公司)。细胞用4

6、0g/L多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋、切片。步骤按细胞凋亡试剂盒说明书进行。结果判断：细胞核被染成棕黄色为阳性。每张切片在400倍高倍视野下随机取20个视野，计数阳性细胞数。　　1.6流式细胞仪(FCM)分析　　3ml培养液含5×105个细胞培养于6孔板,PBS液洗涤2遍，再用预冷的体积分数70%乙醇固定，4℃过夜，采用PI(50mg/L)染色分析亚二倍体峰，分析细胞凋亡比例。重复实验10次。　　1.7FCM检测caspase3表达　　取细胞悬液(约1×106个/ml)，低速离心除去固定液，PBS洗2次。抗caspase3抗体的标记采用间接荧光免疫

7、法。将上述制备好的单细胞悬液用PBS洗2次，分别用加入1∶200稀释的特异性抗体50μl，37℃水浴30min，离心弃上清，加人1∶200稀释的FIFCIgG100μl,37℃水浴30min，离心弃上清，PBS洗1次以去除未结合的荧光抗体。上机前加人1mlPBS，400目筛网过滤，上机分析。caspase3蛋白表达量以平均荧光强度表示。　　1.8统计学方法　　计量资料描述采用x±s表示，用SPSS12.0对数据进行统计学处理。　　2结果　　2.1TUNEL染色结果　　TUNEL染色显示凋亡的细胞核内有分布均匀的深蓝色颗粒，体积等于或小于正常胞核，凋亡细

8、胞呈孤立、散在分布。再灌注后细胞凋亡数明显增加。对照组细胞凋亡数为