靶向smpd1基因的rna干扰对人成纤维细胞凋亡的保护作用

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1、靶向SMPD1基因的RNA干扰对人成纤维细胞凋亡的保护作用高军，周灿权张仁礼，马芸【摘要】【目的】以人包皮成纤维细胞（HFF）为模型，通过系统比较针对不同靶点的小干扰RNA(siRNA)对酸性鞘磷脂酶1（SMPD1）基因的沉默效果，筛选获得最有效的小干扰RNA序列，同时观察沉默SMPD1对细胞凋亡的保护作用。【方法】设计合成三对靶向SMPD1基因的小干扰RNA作为实验组，同时设立阴性对照组和脂质体组(lipofectamine2000)，瞬时转染原代培养的HFF细胞，采用荧光定量RT-PCR法及PD1表达抑

2、制情况，并用化疗药物丝裂霉素诱导细胞凋亡，MTT法检测siRNA转染对细胞的保护作用。【结果】小干扰RNA1，2，3对SMPD1基因mRNA的抑制效率分别为96.3％，39％，63.2％，以siRNA1最高，最佳浓度为50nmol/L，最佳作用时间为48h。SMPD1蛋白在48h出现沉默效果，96h开始恢复。50nmol/L的siRNA1可以有效抑制化疗药物丝裂霉素引起的细胞凋亡，细胞存活率为73.8％，与对照组存活率65.4％比较差异具有统计学意义。【结论】三对siRNA均具有一定的靶基因沉默效果，其中s

3、iRNA1效果最佳，沉默效率达到96.3％；靶向SMPD1基因的siRNA能有效抑制人成纤维细胞的凋亡。【关键词】siRNA；SMPD1；成纤维细胞;凋亡1材料和方法1.1细胞培养选取自身表达SMPD1基因的人包皮成纤维细胞（humanforeskinfibroblast，HFF），作为本实验的实验材料。取2005年7月至2006年7月在中山大学附属第一医院门诊日间手术室进行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童切除的包皮组织，进行成纤维细胞的原代培养。在超净台上操作，尽量去除皮下疏松结缔组织，将包皮放入含青霉素

4、（100U/mL，Sigma）和链霉素（100?滋g/mL，Sigma）的PBS液中漂洗两次，加入2.5g/L胰蛋白酶（Sigma），4℃过夜冷消化。次日取出包皮，无菌条件下去除褐色的表皮层，留下白色的真皮层。将组织剪碎移入离心管中，加入1g/LⅣ型胶原酶（Sigma），37℃消化1～2h。用吸管反复吹打使细胞分散，100目细胞筛网过滤后离心，1000r/min(r=15cm)，5min。弃上清，加入含100mL/L胎牛血清、100U／mL青霉素和100?滋g／mL链霉素的高糖DMEM培养液（Gibco）重

5、悬细胞，接种至培养瓶中，置体积分数为5%CO2、37℃培养箱培养，第3天换液，第5天细胞融合90%，可进行传代。取第3至第9代细胞进行实验。1.2siRNA设计合成根据文献[3]报道的方法从GENEBANK中检索出人类SMPD1mRNA全序列（GeneID:6609），通过同源性比对，找出SMPD1的保守区。利用保守区序列进一步与人类基因组进行比对，找出SMPD1的特异序列，针对这些特异序列设计一系列siRNA的序列，然后通过检证性比对筛选特异性高的siRNA序列进行合成。共合成3对19bp的siRNA，另

6、设随机序列notargetsiRNA(NTsiRNA)作为阴性对照。SiRNA序列如下：siRNA1正义链5＇-gucuauucaccgccaucaa-3＇，反义链5＇-cagauaaguggcgguaguu-3＇；siRNA2正义链5＇-cuaccuacaucggccuuaa-3＇，反义链5＇-gauggauguagccggaauu-3＇；siRNA3正义链5＇-uuaccguguguaccaaaua-3＇，反义链5＇-aauggcacacaugguuuau-3＇。阴性对照正义链5’-uucuccgaac

7、gugucacgu-3’,反义链5’-acgugacacguucggagaa-3’。由广州锐博生物公司合成。1.3优化转染条件用Invitrogen公司的Blockittransfectionkit优化转染条件。按照说明书操作，转染前一天细胞消化接种24孔板，用不含抗生素的生长培养基，使转染时细胞30％～50％融合。转染当天更换培养板中的培养基，每孔加400?滋Lopti-MEM低血清培养基。用50?滋LOpti-MED低血清培养基（不加血清）稀释Block-itFluorescentoligo，轻柔混合。

8、用50?滋LOpti-MED低血清培养基稀释lipofectamine2000，轻柔混合，室温下孵育5min。将稀释后的Block-itFluorescentoligo和lipofectamine2000轻柔混合，室温下孵育20min。将此复合物加到培养板中，前后摇晃板以混合。置体积分数为5％CO2、37℃培养箱培养，6h后换完全培养液，至多24h用荧光显微镜观察荧光信号强弱。FITCfilter（?骔ex=49