rna干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞tgfβ1刺激

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1、RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGFβ1刺激【摘要】目的体外构建结缔组织生长因子（CTGF）序列特异性小干扰RNA表达载体，转染导入后研究其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKFs）胶原蛋白分泌的影响。方法体外构建CTGF序列特异性小干扰RNA质粒表达载体，Dosper脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后，观察加入10ng/mL剂量的转化生长因子（TGFβ1）刺激前后胶原蛋白水平的变化。结果转染小干扰RNA质粒后，胶原蛋白分泌水平降为正常表达的51.6%；经TGFβ1刺激后，蛋白表达仍无明显变化。结论小干扰RNA质粒表达

2、载体可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白分泌，为临床上瘢痕疙瘩的基因治疗提供理论依据。【关键词】RNA干扰；人瘢痕成纤维细胞；胶原蛋白；转化生长因子β1Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofsmallinterferingRNA(siRNA)expressingplasmidstargetingconnectivetissuegroankeloidfibroblasts(HKFs).MethodsConstructedsiRNAexpressingplasmidstar

3、getingCTGFeasuredby3HprolineincorporationmethodbeforeandafterHKFsulatedbytransforminggroL.ResultsThecollagenlevelallevelandhadnoobviouschangeevenafterstimulatedbyTGFβ1.ConclusionThedoidsmaybeaneankeloidfibroblast;collagen;TGFβ1瘢痕疙瘩（Keloid，KD）是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引

4、发的以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的过度瘢痕化，其发病机制是异常表达的转化生长因子（TGFβ1）通过结缔组织生长因子（CTGF）促进病理性瘢痕的形成［1］。已有研究表明,TGFβ是一类具有多种生物学功能的蛋白多肽类物质,在创伤愈合的所有阶段均发挥了重要作用［2］。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是由双链RNA（doublestrandsRNA，dsRNA）介导的基因沉默技术，通过长度21～23个核苷酸的双链小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)与细胞内相对

5、应的mRNA结合，特异性降解mRNA，抑制蛋白表达，具有特异性、高效性和方便性等显著特点［23］。本研究旨在将体外构建的结缔组织生长因子siRNA表达载体转染导入人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKFs）后，观察TGFβ1刺激前后细胞外胶原蛋白分泌水平的变化，为瘢痕疙瘩的基因治疗提供依据。1材料与方法1.1材料质粒pGenesil1（武汉晶赛生物公司），Dosper脂质体（Roche，德国），DMEM高糖培养基（Gibco，美国），液体闪烁仪（SN6930，上海）。1.2方法1.2.1细胞培养选用瘢痕疙瘩患者（诊断标准

6、参见文献［4］）术中切除的组织，用组织法分离HKFs，加入10%小牛血清的DMEM培养基，培养条件为37℃、5%CO2，胰酶消化传代，取体外培养第5代细胞。1.2.2siRNA表达载体的构建、鉴定和转染方法详见文献［5］，本实验采用抑制效率最高的靶序列进行转染。转染细胞分为重组质粒组和空质粒组，每组各5份细胞样本。1.2.33H脯氨酸（3Hpro）渗入法检测胶原蛋白将3Hpro原液配成20×稀释的使用液，在每组细胞中加入20μL，37℃、5%CO2培养6h。弃去培养液，每孔加入0.5mL冰预冷的10%TCA，4

7、℃固定30min后弃去TCA。用冰预冷的PBS洗细胞2次后，换加0.5mL1%SDS、0.1mmol/LNaOH裂解液，37℃过夜裂解细胞。每组取细胞裂解液0.3mL加入装有8mL闪烁液的瓶中，剧烈振荡，室温静置暗处，待其完全溶解后用闪烁仪计数。1.3统计学方法采用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析，实验计量结果采用均数±标准差(±s)表示。2结果重组质粒组胶原蛋白的分泌水平与空质粒组相比，转染导入重组的小干扰RNA质粒表达载体后细胞外胶原蛋白分泌水平下降至51.6%，抑制率达48.4%［胶原蛋白抑制率%=（1

8、-各组蛋白含量÷空质粒组蛋白含量）×100%］，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。即使在TGFβ1刺激后，胶原蛋白分泌水平仅为正常的48.7%，抑制率达51.3%，差异仍具有统计学意义（P＜0.05），见表2。表1转染后重组质粒组胶原蛋白的表达表2TGFβ1刺激后重组质粒组胶原蛋白的表达3讨论胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物性高