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时间:2018-11-01
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1、RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGFβ1刺激【摘要】目的体外构建结缔组织生长因子(CTGF)序列特异性小干扰RNA表达载体,转染导入后研究其对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKFs)胶原蛋白分泌的影响。方法体外构建CTGF序列特异性小干扰RNA质粒表达载体,Dosper脂质体转染人瘢痕疙瘩成纤维细胞后,观察加入10ng/mL剂量的转化生长因子(TGFβ1)刺激前后胶原蛋白水平的变化。结果转染小干扰RNA质粒后,胶原蛋白分泌水平降为正常表达的51.6%;经TGFβ1刺激后,蛋白表达仍无明显变化。结论小干扰RNA质粒表达
2、载体可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白分泌,为临床上瘢痕疙瘩的基因治疗提供理论依据。【关键词】RNA干扰;人瘢痕成纤维细胞;胶原蛋白;转化生长因子β1Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofsmallinterferingRNA(siRNA)expressingplasmidstargetingconnectivetissuegroankeloidfibroblasts(HKFs).MethodsConstructedsiRNAexpressingplasmidstar
3、getingCTGFeasuredby3HprolineincorporationmethodbeforeandafterHKFsulatedbytransforminggroL.ResultsThecollagenlevelallevelandhadnoobviouschangeevenafterstimulatedbyTGFβ1.ConclusionThedoidsmaybeaneankeloidfibroblast;collagen;TGFβ1瘢痕疙瘩(Keloid,KD)是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引
4、发的以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的过度瘢痕化,其发病机制是异常表达的转化生长因子(TGFβ1)通过结缔组织生长因子(CTGF)促进病理性瘢痕的形成[1]。已有研究表明,TGFβ是一类具有多种生物学功能的蛋白多肽类物质,在创伤愈合的所有阶段均发挥了重要作用[2]。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(doublestrandsRNA,dsRNA)介导的基因沉默技术,通过长度21~23个核苷酸的双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)与细胞内相对
5、应的mRNA结合,特异性降解mRNA,抑制蛋白表达,具有特异性、高效性和方便性等显著特点[23]。本研究旨在将体外构建的结缔组织生长因子siRNA表达载体转染导入人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKFs)后,观察TGFβ1刺激前后细胞外胶原蛋白分泌水平的变化,为瘢痕疙瘩的基因治疗提供依据。1材料与方法1.1材料质粒pGenesil1(武汉晶赛生物公司),Dosper脂质体(Roche,德国),DMEM高糖培养基(Gibco,美国),液体闪烁仪(SN6930,上海)。1.2方法1.2.1细胞培养选用瘢痕疙瘩患者(诊断标准
6、参见文献[4])术中切除的组织,用组织法分离HKFs,加入10%小牛血清的DMEM培养基,培养条件为37℃、5%CO2,胰酶消化传代,取体外培养第5代细胞。1.2.2siRNA表达载体的构建、鉴定和转染方法详见文献[5],本实验采用抑制效率最高的靶序列进行转染。转染细胞分为重组质粒组和空质粒组,每组各5份细胞样本。1.2.33H脯氨酸(3Hpro)渗入法检测胶原蛋白将3Hpro原液配成20×稀释的使用液,在每组细胞中加入20μL,37℃、5%CO2培养6h。弃去培养液,每孔加入0.5mL冰预冷的10%TCA,4
7、℃固定30min后弃去TCA。用冰预冷的PBS洗细胞2次后,换加0.5mL1%SDS、0.1mmol/LNaOH裂解液,37℃过夜裂解细胞。每组取细胞裂解液0.3mL加入装有8mL闪烁液的瓶中,剧烈振荡,室温静置暗处,待其完全溶解后用闪烁仪计数。1.3统计学方法采用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析,实验计量结果采用均数±标准差(±s)表示。2结果重组质粒组胶原蛋白的分泌水平与空质粒组相比,转染导入重组的小干扰RNA质粒表达载体后细胞外胶原蛋白分泌水平下降至51.6%,抑制率达48.4%[胶原蛋白抑制率%=(1
8、-各组蛋白含量÷空质粒组蛋白含量)×100%],差异具有统计学意义(P<0.05),见表1。即使在TGFβ1刺激后,胶原蛋白分泌水平仅为正常的48.7%,抑制率达51.3%,差异仍具有统计学意义(P<0.05),见表2。表1转染后重组质粒组胶原蛋白的表达表2TGFβ1刺激后重组质粒组胶原蛋白的表达3讨论胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物性高
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