cdc2l1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达与其对瘢痕疙瘩成纤维细胞影响的研究

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1、活性抑制剂的天然靶位【131。靶向hCR常用的方法有RNA干扰(I矾Ai)、反义核苷酸技术封闭、锤头状核酶切割等。其中小干扰I矾A(siRNA)更是在哺乳动物细胞中显示了强大的、有效的RNA干扰能力，因而化学合成的21．23核昔酸的siRNA或质粒表达的小发夹RNA(shI矾A)被常规用于基因沉默研究。科研人员利用脂质体介导的细胞内shIⅢA表达技术，该shRNAs在体内再被加工为siI矾As，这种方式有可能导致有效的、长期的基因沉默。表达shI矾A的质粒载体正被广泛用于抗病毒、抗肿瘤和神经系统疾病的研究。脂质体最常用于体外细胞的转染，以后又被用做基因体内导入的载体

2、。脂质体可以与DNA形成复合物，保护DNA不被核酸酶降解，与细胞膜结合后形成内吞小体，把DNA释放到细胞浆。脂质体由脂质双分子层组成的封闭囊泡，无毒和无免疫原性，因此成为基因治疗、IⅢAi分子递送的重要工具，广泛受到学者的青睐。国外研究CDC2Ll基因时，所选的对象是肿瘤患者或实验动物，没有发现在瘢痕疙瘩方面的研究。所采取的研究方法多是RT-PCR，SNP分析，基因芯片检测技术，分子杂交技术，单链构象多态性分析，比较基因组杂交。国内虽然有研究CDC2Ll基因在瘢痕疙瘩中的作用，所采用的技术是比较基因组杂交技术(CGH)，变性高效液相色谱法结合测序筛选和鉴定，但由于研

3、究时涉及到多个基因的作用及相互作用，不能体现其中一个基因在瘢痕疙瘩中的作用。鉴于上述原因，本课题选择利用基因治疗策略及方法来研究单个相关基因(CDC2L1)在瘢痕疙瘩发病机制所起的作用及其意义。研究目的我们运用pGPU6／GFP／NeosiRNAExpressionvector构建重组质粒，利用脂质体转染来沉默瘢痕疙瘩成纤维细胞中的hCR基因表达，以观察CDC2Ll基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的影响，为研究CDC2LI基因在瘢痕疙瘩中的作用提供可靠的依据和有效的手段。研究方法lCDC2L1基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达水平的测定通过q．PCR检测瘢痕疙瘩成纤维细胞和

4、人正常皮肤成纤维细胞中CDC2L12基因的mI矾A表达水平。2l矾Ai重组质粒的构建穿梭质粒的构建利用GenePhanlla公司的siRNA靶序列分析软件设计siRNA靶序列，再根据siI斟A设计原则，选择针对hCR(GenBaIlknumber984)的2Int的序列(CDC2L1．1636，CDC2L1．1813，CDC2L1．1962位碱基)作为特异性siI斟A靶序列。化学合成62nt寡核苷酸和它的互补链，退火、连接到B锄Hl／BbsI线性化的pGPU6／GFP／NeosiRNAExpressionVector，构建重组穿梭质粒pGPU6-hCR。插入序列采用

5、Bbsl和Pstl酶切和测序的方法来证实。siRNA的阴性和阳性对照寡核营酸被用来构建pGPU6．shNC，pGPU6．shhGAPDH，，构建方法同hCR。该质粒也用酶切和测序的方法证实。3筛选有效的干扰质粒通过q．PCR检测所构建的重组质粒对CDC2L1基因的抑制效率，从而选择干扰效果较好的重组质粒为实验的干扰靶点进行下游研究。4I州Ai重组质粒沉默人瘢痕疙瘩成纤维细胞的hCR基因用RNAi重组质粒和对照(pGPU6．shNC，pGPU6．sllllGAPDH质粒，脂质体)转染瘢痕疙瘩成纤维细胞，同时设立对照。绘制生长曲线、Westemblot法测定CDC2L1

6、基因的蛋白变化，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。研究结果l通过q．PCR检测证明CDC2Ll基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中IIl】[必A的表达水平明显升高，是人正常皮肤成纤维细胞中mRNA表达水平的38．85倍。2经酶切和测序鉴定证明CDC2L1．shIⅢA模板成功插入到pGPU6表达质粒中，成功构建了3个shRNA表达质粒。3通过q．PCR鉴定证明CDC2L1．1636干扰效率为67．33％，siI矾A能够有效降低CDC2L1mI玳A水平，CDC2L1．1813和CDC2L1．1962抑制效率非常低，几乎没有抑制效率，从而选择CDC2L1．1636为试验的干扰靶点进

7、行研究。4MTT结果显示GPU6．CDC2L1．sIlI斟A．1636质粒组较脂质体组，pGPU6．shNC对照组和未转染的空白细胞组生长速度有明显差异，差异有统计学意(正0．05)。Westemblot法测定CDC2L1基因的蛋白变化，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期，与pGPU6-shNC质粒对照组、pGPu6一shhGAPDH质粒对照组、脂质体对照组和空白对照组相比，pGPU6．CDC2L1．shRNA．1636质粒组CDC2Ll蛋白表达水平相应下降较明显，细胞凋亡数目增加有明显的差异，差异有统计学意义(p<0．05)。结论以上实验结果表明，CDC2Ll基