rna干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞tgfβ1刺激后胶原合成的影响

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1、RNA干扰对人瘢痕疙瘩成纤维细胞TGFβ1刺激后胶原合成的影响【关键词】RNA干扰；人瘢痕成纤维细胞；胶原蛋白；转化生长因子β1Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofsmallinterferingRNA(siRNA)expressingplasmidstargetingconnectivetissuegroankeloidfibroblasts(HKFs).MethodsConstructedsiRNAexpressingplasmidsta

2、rgetingCTGFeasuredby3HprolineincorporationmethodbeforeandafterHKFsulatedbytransforminggroL.ResultsThecollagenlevelallevelandhadnoobviouschangeevenafterstimulatedbyTGFβ1.ConclusionThedoidsmaybeaneankeloidfibroblast;collagen;TGFβ1瘢痕疙瘩（Keloid，KD）是皮肤损伤

3、如创伤、烧伤或手术后引发的以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的过度瘢痕化，其发病机制是异常表达的转化生长因子（TGFβ1）通过结缔组织生长因子（CTGF）促进病理性瘢痕的形成［1］。已有研究表明,TGFβ是一类具有多种生物学功能的蛋白多肽类物质,在创伤愈合的所有阶段均发挥了重要作用［2］。RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是由双链RNA（doublestrandsRNA，dsRNA）介导的基因沉默技术，通过长度21～23个核苷酸的双链小干扰RNA(smallinterf

4、eringRNA，siRNA)与细胞内相对应的mRNA结合，特异性降解mRNA，抑制蛋白表达，具有特异性、高效性和方便性等显著特点［23］。本研究旨在将体外构建的结缔组织生长因子siRNA表达载体转染导入人瘢痕疙瘩成纤维细胞（HKFs）后，观察TGFβ1刺激前后细胞外胶原蛋白分泌水平的变化，为瘢痕疙瘩的基因治疗提供依据。1材料与方法1.1材料质粒pGenesil1（武汉晶赛生物公司），Dosper脂质体（Roche，德国），DMEM高糖培养基（Gibco，美国），液体闪烁仪（SN6930，

5、上海）。1.2方法1.2.1细胞培养选用瘢痕疙瘩患者（诊断标准参见文献［4］）术中切除的组织，用组织法分离HKFs，加入10%小牛血清的DMEM培养基，培养条件为37℃、5%CO2，胰酶消化传代，取体外培养第5代细胞。1.2.2siRNA表达载体的构建、鉴定和转染方法详见文献［5］，本实验采用抑制效率最高的靶序列进行转染。转染细胞分为重组质粒组和空质粒组，每组各5份细胞样本。1.2.33H脯氨酸（3Hpro）渗入法检测胶原蛋白将3Hpro原液配成20×稀释的使用液，在每组细胞中加入20μL，

6、37℃、5%CO2培养6h。弃去培养液，每孔加入0.5mL冰预冷的10%TCA，4℃固定30min后弃去TCA。用冰预冷的PBS洗细胞2次后，换加0.5mL1%SDS、0.1mmol/LNaOH裂解液，37℃过夜裂解细胞。每组取细胞裂解液0.3mL加入装有8mL闪烁液的瓶中，剧烈振荡，室温静置暗处，待其完全溶解后用闪烁仪计数。1.3统计学方法采用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析，实验计量结果采用均数±标准差(±s)表示。2结果重组质粒组胶原蛋白的分泌水平与空质粒组相比，转染导入重组的小干扰

7、RNA质粒表达载体后细胞外胶原蛋白分泌水平下降至51.6%，抑制率达48.4%［胶原蛋白抑制率%=（1-各组蛋白含量÷空质粒组蛋白含量）×100%］，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。即使在TGFβ1刺激后，胶原蛋白分泌水平仅为正常的48.7%，抑制率达51.3%，差异仍具有统计学意义（P＜0.05），见表2。表1转染后重组质粒组胶原蛋白的表达表2TGFβ1刺激后重组质粒组胶原蛋白的表达3讨论胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物骨、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约

8、占哺乳动物总蛋白的1/3，是人体重要的细胞外基质成份，可作为组织的支持物，对细胞、组织乃至器官行使正常功能并对外伤修复有重大影响，胶原蛋白的异常积聚和降解是纤维化产生的病理学基础。人体胶原蛋白根据功能可分为纤维性胶原和非纤维性胶原两大类，多数是由3条肽组成，3链相互缠绕，形成胶原蛋白分子特有的杆状结构。胶原蛋白基因的表达是本身顺式作用元件、反式作用因子及诸多调控因子相互作用的结果，其中IL1、TGFβ等属于正调节因子，γINF、PGE2、固醇类激素等属于负调节因子，而PDGF