靶向pparγ基因rna干扰对涎腺腺样囊性癌细胞转移影响的研究

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目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6研究论文靶向PPARl,基因RNA干扰对涎腺腺样囊性癌细胞转移影响的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13刚吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯14结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．23附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．25附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．33讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯36结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4l参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41综述过氧化物酶体增殖物激活受体丫(PPAR丫)与相关疾病⋯44致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．68个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．69 中文摘要靶向PPARY基因RN^干扰对涎腺腺样囊性癌细雕究摘要JIIIMIIIll1111111IillllllIIPIIIIIY2337805目的：侵袭性和转移性是恶性肿瘤的本质特征，恶性肿瘤的转移是由包括侵袭肿瘤周围组织，沿顺血液及淋巴系统的运行、在靶器官上大量增殖等步骤组成，而且恶性肿瘤的转移的原因及机制是十分复杂的，与其基因水平上的改变是密切相关的。恶性肿瘤若失去其转移能力，其恶性程度将会大大的降低，但目前在医学科研领域尚没有一个明确的结论能全面的解释恶性肿瘤侵袭及转移现象，故针对于恶性肿瘤侵袭及转移的治疗目前尚无特效的方法，而针对恶性肿瘤转移相关基因的研究已经成为医学科学工作者尝试攻克肿瘤的途径之一。涎腺腺样囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma，SACC)是涎腺最常见的，且最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其发病率居涎腺恶性肿瘤的第二位，该肿瘤生长缓慢，对周围组织浸润性强，治疗后局部易复发，其主要的生物学性状之一是易随血运发生远处转移，而转移的部位以肺为多见，是导致患者死亡的主要原因之一。目前针对涎腺腺样囊性癌(SACC)的治疗主要以手术为主，但是因为其对周围组织侵袭性很强，呈浸润性生长，故很难通过手术一次性切除干净，而且其对化疗及放疗不敏感，预后不佳，对于该肿瘤术后复发及转移的病例的治疗相当棘手，寻找一种针对涎腺腺样囊性癌治疗的有效方法一直是口腔科医学工作者关注的焦点，并且是一道难题。随着针对各种疾病的病因、发展、治疗等过程的基因及分子水平研究的开展及发展，关于涎腺腺样囊性癌基因治疗的相关性研究也逐渐地深入。涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC．LM及肺低转移细胞株SACC．83为同一亲本，两种细胞之间的差异集中在转移的表型上，其中SACC．LM细胞的转移能力明显高于SACC．83细胞。近几年来RNA干扰(对妊interference，对悄i)研究在不同领域的专家学者的共同努力下已经取得了突破性的飞速进展，于2001被(杂志评为年度十大科学进展之一，并且位列2002年十大科学进展的第一位。RNAi现象发现于1995年，从1998年开始逐渐引起人们的关注及重 中文摘要视。使用RNAi技术可以针对性地抑制沉默特定目的基因进而特异性剔除或者关闭目的基因地表达，随着对RNAi技术的深入研究及飞速发展，目前在探索基因功能、传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域均已有RNAi技术的应用。RNAi将体外人工合成的与靶基因的mRNA同源互补的双链RNA(dsRNA)导入细胞，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，属于转录后水平的基因沉默(post-transcriptionalgenesilence，PTGS)。过氧化物增殖体激活物受体(peroxisomeproliferatorsactivatedreceptors，PPAR)是最新发现的一组核激素受体超家族成员之一，其与甲状腺激素受体、类维生素A受体、类固醇激素受体、及维生素D受体一样，均属于核激素受体，亦被称为脂肪酸受体。研究发现：人类的PPAR有三种亚型，即：PPARa、PPAR8(亦称PPARp)及PPARy。其中，PPAR7是目前研究最广泛的一种。最初，科学家们没有发现PPAR的天然配体，然而随着分子生物学相关技术及鉴定方法的不断完善，现在已有数百种PPAR7配体被鉴定出来，并被分为合成配体和天然配体两种。PPARy参与糖尿病、动脉粥样硬化、炎症、肥胖等的病理生理过程并发挥重要作用，PPAR7主要表达于脂肪组织，除脂肪组织外，在人体中的巨噬细胞及其他脂肪储存细胞，如：肝、肾、肺等中均有表达，肌肉组织基本不表达，PPAR7的主要表现形式是PPAR?l，表达范围广泛。近期相关研究发现，在人类口腔颌面部、呼吸系统、消化系统、生殖系统等的恶性肿瘤中均发现PPAR?的表达，并且其表达量的高低与肿瘤的恶性程度及转移与否存在着关系。相关研究表明，通过多种手段作用于恶性肿瘤细胞中的PPAR?及其配体，能够影响恶性肿瘤的生长及转移，并己应用于肺癌、乳腺癌等一些恶性肿瘤的治疗中。PPAR7基因定位于染色体3p25，含有9个外显子，其基因组结构覆盖100kb。在口腔颌面部恶性肿瘤中，涎腺腺样囊性癌(SACC)极易经血运发生远处转移，且转移以肺部多见。作为恶性肿瘤的重要特征之一，肿瘤若失去转移特性，那么恶性度将大大降低，对肿瘤转移相关的研究是攻克肿瘤治疗难题不可缺少的重要基础工作。PPAR7作为目前研究最广泛、最成熟的核激素受体，有研究表明，其在SACC肺高、低转移细胞株中的表达存在差异，肺高转移细胞株的表达量明显高于肺低转移细胞株，但目 中文摘要前有关PPARy与SACC远处肺转移相关性的报道很少。本实验采用RNA干扰(RNAi)技术特异性的沉默PPAR7基因的表达，并通过细胞体外迁徙能力实验及建立裸鼠体内涎腺腺样囊性癌肺转移模型，进而探讨PPARy基因沉默后对SACC肺转移的影响，进一步丰富对SACC转移的研究。方法：1PT-PCR检测两种细胞株PPAR丫基因表达差异分别提取两种细胞的总RNA，反转录成cDNA，以此为模板，应用PT-PCR技术检测PPAR7基因表达量的不同，13-action基因作为对照，应用SPSS13．0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行统计学数据处理。2PPAR7基因siRNA表达载体的构建依据小分子干扰RNA(smallinterfering，siRNA)的设计原则，由武汉晶赛公司设计并构建PPAR7基因siRNA表达载体，同时选取与PPARy基因同源性较差的序列作为阴性对照，构建阴性对照载体，最后将U6启动子序列按照Genbank序列(ACCessionnumberX06980)体外化学合成后克隆到PPAR7基因siRNA表达载体，替代原有的启动子，最终获得所需的siRNA表达载体。3转染按Invitrogen的产品说明将阳离子脂质体Lipofectamine2000和阳性质粒表达载体、阴性质粒表达载体、空白质粒分别转染涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC．LM和肺低转移细胞株SACC．83，转染后细胞分别命名为：SACC．LM阳性转染组，SACC—LM阴性转染对照组，SACC．LM空白转染对照组；SACC．83阳性转染组，SACC．83阴性转染对照组，SACC．83空白转染对照组。4镜下观察质粒转染情况转染48h后荧光倒置显微镜下分别在培养各组细胞的各组孔内随机取六个视野观察细胞转染效率，应用SPSS13．0软件单因素方差分析方法 中文摘要(ANOVA)进行统计学数据处理。5RT-PCR检测PPARl,基因干扰效率分别提取转染细胞和未转染细胞的总RNA，反转录成eDNA，以此为模板，应用RT．PCR技术检测PPARy基因表达量的改变，p-aetion基因作为对照。6Transwell小室检测肿瘤细胞体外迁徙能力改变用Matrigel基质膜模拟细胞外基质及Transwell小室检测PPARy基因干扰沉默后SACC．LM及SACC．83细胞粘附迁徙能力的改变，同时以转染阴性质粒及空白质粒的细胞做对照，应用SPSS13．0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行统计学数据处理。7裸鼠体内检测肿瘤细胞转移能力的改变。4W龄雌性BALB／Cnu／nu裸鼠104只，随机分成8组，4号注射器于距尾静脉尖2-3em处尾静脉注入细胞悬液O．1ml／只，1W后重复注射一次。8W后将裸鼠处死，严格无菌条件下解剖，取出肺脏。在显微镜下用手术剪剥离所有肉眼可见转移灶，将分离的转移灶用电子天平称重并记录，应用SPSS13．0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行统计学数据处理。结果：1以[3-action为内参，实验所得的条带中，SACC．LM组条带明显较SACC．83组明亮，所得数据经统计学分析，P=-0．oo0．01，无明显差异。3RNA干扰后所得条带中，SACC—LM及SACC．83干扰组条带较其他三组对照组相比明显变暗，说明RNA干扰后SACC．LM及SACC．83细胞中PPAR),基因表达量均显著降低。4RNA干扰后SACC．LM及SACC一83细胞穿过Matrigel人工基底膜 中文摘要的细胞数量均显著减少，P=0．00<0．05，而SACC．LM阳性转染组细胞穿膜数均值与SACC．83组、SACC一83阴性转染对照组及SACC一83空白转染对照组相近，P=0．444>0．05。58组裸鼠体内除肺脏以外，其他部位均未发现结节及淋巴结肿大。SACC．LM组经PPAR3,基因沉默干扰后的细胞株裸鼠体内的肺部转移灶在肉眼下明显减少变小，且SACC．83组经PPAR?基因干扰后的细胞株裸鼠体内的肺部在肉眼下观察无明显可见转移灶。SACC-LM阳性转染组、SACC．83阳性转染组细胞裸鼠体内肺转移灶重量均值与各自对照组细胞株相比显著减轻，P=0．00<0．05，有显著差异，而SACC．LM阳性转染组细胞裸鼠体内肺转移灶重量均值与SACC．83组、SACC．83阴性转染对照组及SACC．83空白转染对照组相比，P=0．301>O．05，无显著差异。结论：特异性地抑制PPAR?基因，沉默其表达后，SACC细胞株体外迁徙能力及肺部转移能力明显降低，证实，特异性地抑制SACC细胞株PPAR3,基因的表达能够减低其转移能力，PPARY基因在SACC转移过程中发挥重要作用，PPAR?有可能成为治疗SACC的新的靶点。关键词：涎腺腺样囊性癌；远处转移；过氧化物酶体增殖物激活受体丫(PP触Ⅵ)；细胞株；RNA干扰(RNAi) 英文摘要ThestudyoftheimpactaboutcelltransferwhentargetinginterferencethePPAR?mRNAofSalivaryglandadenoidcysticCarClnomaABSTRACTObjectives：Theinvasivenessandtransitivityistheessentialcharacteristicsoftherioma．Thetransferoftheriomaiscomposedofinvadingsurroundingtissueofthetumor，movingalongthebloodandlymphaticsystem，proliferationinthetargetorgansandSOon，andthereasonandthemechanismofitwhichiscloselyrelatedtothechangeofitsgenelevelisverycomplicated．Ifthetheriomalosesitsabilityoftransfer，thelevelofmalignancywillgreatlydecrease．ThereiSnotaclearconclusionthatcaninterprettheinvasionandthemetastasisofthemalignanttumorroundlyinthemedicalscientificresearchSOfar．andthereiSnoeffectivemethodtothetreatmentoftheinvasionandmetastasisofmalignanttumoratpresent．Thestudywhichisaimedatthegenethatrelatedtothemetastasisofthemalignanttumorhasbecomeoneofthewaysinwhichmedicalscienceworkerstrytoconqurthetumor．Salivaryadenoidcysticcarcinoma(SACC)，oneofthemostcommonandthemostaggressivesalivaryglandcancers，isinasecondplaceintheincidenceofthesalivaryglandmalignanttumor．Itgrowsslowly，iseasytorelapseaftertreatmentinlocalrecurrence，anditsabilityofinvadingsurroundingtissuesisstrong．Oneofitsmainbiologicalcharactersisthatitiseasytohavedistantmetastasisalongbood，andthecommonpositionislung，whichhasbecomeoneofthemainreasonsthatleadtothepatients’death．Atpresenttheprimarytherapeuticmethodissurgery，butitisdifficulttomakeaone-timecleansurgerybecauseofitsinvasiveness．ItiSnotsensitivetochemotherapyandradiotherapy，hasabadprognosis，andthetreatmentoftherecurrenceandmetastasisitcausesisquitedifficult，SOlooking．forakindofeffectivemethodtotreatthesalivaryglandadenoidcysticcarcinomahasbecomethefocusofattentionandadifficultproblemofthestomatology6 英文摘要medicalworkers．Withthedevelopmentofthegeneticandmolecularlevelresearchonthecauses，thedevelopmentandthetreatmentprocessofvariousdiseases，theresearchofgenetherapyonthesalivaryglandsof虹anyangcysticcanceralsograduallyin-depths．hi曲pulmonary-metastaticcelllineSACC-—LMandlowpulmonary·-metastaticcelllineSACC-·83hasthesameparents，thedifferencesbetweenthetwokindsofcellfocusesonthetransferphenotythattheSACC-LMcellline’StransfercapacityisobviouslyhigherthanthatoftheSACC．83cellline．Inrecentyears，theresearchofRNAi(RNAinterference)hasmadebreakthroughprogressattributingtotheexpertsfromvariousfields，hasbeenjudgedoneofthetenmajorscientificprogressin2001by{Science}，andtakenthefirstplaceofthetenimportantscientificprogressin2002．TheRNAiphenomenonwasdiscoveredin1995，andarousedpeople’Sconcernandattentionbeginningfrom1998．UsingtheRNAitechnologyCaneliminateorclosetheexpressionofspecificgenebyrestrainingsilentspecificgene，SOthistechnologyhasbeenwidelyusedinthefieldsofexploringgenefunction，infectiousdiseasesandthemalignanttumorgenetherapy．RNAinterference(RNAi)belongstothepost—transcriptionalgenesilence，anditimportsdsRNAwhichiscompoundedinvitroandhomologousandcomplementarywithtargetgenesmRNAintocells．PPAR(peroxisomeproliferatorsactivatedreceptors)，oneofthegroupsofnuclearhormonereceptorsuperfamily，isnewlydiscoveredthatitbelongstothenuclearhormonereceptor，asthesameasthyroidhormonereceptor，retinoidsreceptors，steroidhormonereceptor，andvitaminDreceptor，meyarealsoknownasfattyacidreceptor．Thestudyfoundthatthehuman’SPPARhasthreesubtypes，namely：PPARalpha，PPARdeltaalsocalledPPARbeta)andPPAR1，．Amongthem，thePPARYisthemostwidelyresearchonenow．Atfirst，therehasnoPPARnaturalligandbefound，while谢t11thecontinuousimprovementofmolecularbiologyandappraisalmethods，therehasbeenhundredsofPPAR丫ligandswereidentifiednow，andbedividedintosyntheticligandsandnaturalligand．ThePPAR丫participatesinlotsof7 英文摘要diseases'oathoohysiological，Suchas：diabetesmellitusdiseasespathophysiologmalprocessbumellltUS，，atherosclerosis，inflammation，obesity，etcr，andplaysanimportantrole．ThePPARYmainlyexpressesinadiposetissue，andalsoexpressesinthebodymacrophagesandotherfatstoragecell，suchas：liver，kidney，lung，etcr，butwecan’tfonditsexpressesinmuscletissuealmost，andPPAR丫1isitsmajorpattemofmanifestation，expressingwidely．Recentstudiesfoundthat，PPAR丫isexpressedinthemalignanttumorsinhumanoralandmaxlllotaclal，●。●●''一●respiratorysystem，digestivesystemandreproductivesystem，andtheexpressedquantityisrelatedtothemalignantdegreeandthetransferornotofthetumor．Theresearchshowsthat，dealingwiththePPAR丫anditsligandthroughavarietyofmeanscallaffectitsgrowthandmetastasis，andthishasbeenappliedtothetreatmentofthemalignanttumor，suchas：lungcancer,breastcancer，etcr．ThePPAR丫genelocatesinthechromosome3p25，containingnineexon．anditsgenomicstructurecovers100KB．Amongtheoralandmaxillofacialmalignanttumor，‘SACC(salivaryglandadenoidcysticcarcinoma)Canarisedistantmetastasiseasilythroughbloodtransport，andthemostofthetargetplaceisthelungs．Asoneoftheimportantfeaturesofmalignanttumor，itsmalignantdegreewillbereducedinfinitelyifthetumor10sesthepropertyoftransfer．Theresearchontherelativityoftumormetastasisisindispensable，importantandbasalinconqueringthecancertreatmentproblem．乃eresearchshowsthattheexpressionofPPARYwhichiSstudiedasthemostwidelyand。maturehormonereceptorisdifferentinthehighpulmonary．metastaticcelllineandlowpulmonary-metastaticcelllineofSACC，theexpressionquantityofhighpulmonary-metastaticcelllineishigherthanlowpulmonary‘metastaticcelllineobviously．ButthereisfewreportsabouttherelationshipbetweenPPARYandSACCdistantmetastasis．ThisexperimentUSeSthe对忪I(对姒interference)technologytosilencemePPAR丫gene’expressionwithspecificity，andresearchestheeffectaboutthesalivaryglandadenoidcysticcarcinomalungtransfera船rPR气R丫genehasbeensilencedthroughestablishmentSalivaryglandadenoidcysticcarcinomalungtransfermodelin8 英文摘要————————————————————————————————————————————————————————————一nudemouse’body，tofurtherenrichtheresearchesabouttheSACCtransfer．Methods：1DetectthedifferencesoftheexpressionofPPAR丫geneofthesetwokindsofcellsabovebyP。I‘一PCR·ExtractingthetotalRNAofthesetwokindsofcells，reversetranscribingitintocDNA，astemplate，detectingthedifferenceofPPAR丫expressionquantitybyPT—PCRbasedont11ecDNA，p-actongeneasacomparison，analysisingthestatisticaldatabythemethodsofsinglefactoranalysisofvariance(ANOVA)ofSPSS13．0．2Constructthes删A’expresscarrierofthePPARY砀eWuhanGenesilBiotechnologyCo．LtddesignsandconstructsthePPAR1，siRNAexpresscarrieraccordingtothedesignprinciplesofthesmallmoleculeinterferenceRNA(siRNA，smallinterfering)．Atthesametime，theyselectthesequencewhichislackofhomologycomparewithPP!AR丫toconstructthenegativecontrolcarrier．Intheend，theyhaveclonedmeU6promotersequencesintoPPAR丫si附蛆expresscarrier．U6wascompoundedaccordingtotheGenbanksequence(ACCessionnumberX06980)invitro，replacingoriginalpromoter，obtainingthesjRNAexpresscarrierwhichweneedfinally．3ThetransfectionAccordingtotheproductdescriptionofInvitrogen，wetransfectSACC_LMandSACC．83cellswithationicliposomesLipofectamine2000，positiveplasmidexpressioncarrier，negativeplasmidexpressioncareer·andblank一●_●●plasmid，namingthesecellswhichhavebeentransfectedas：SACC-LMpositivegroup，SACC-LMnegativecontr01group，SACC-LMblankcontrolgroup；SACC-83positivegroup，SACC-83negativecontrolgroup，SACC一83blankcontr01group．4Observeplasmidtransfectconditionunderthemicroscope9 英文摘要Pickupsixfieldsrespectivelyintheseholeswhereisculturingsuchcellsrandomly，underthemicroscope，48hlater，observethetransfectefficiency，analysisstatisticaldatabythemethodofsinglefactoranalysisofvariance(ANOVA)ofSPSS13．0．5DetecttherestrainefficiencyPPARYbyPT—PCRExtractthetotalRNAofthesecellsthosehavebeentransfectedandhavenotbeentransfected，reversetranscribethemintoeDNA，anddetectthechangeofPPAR1,expressionquantitybyPT—PCRonthebaseofthecDNA，13-actongeneasacomparison．6DetectthechangeofthemigrationabilityoftumorcellsinvitrobyTranswellroomDetectthechangofadhesionmigrationabilityofSACC—LMandSACC．83whenPP劁RYhasbeensilencedwiththemethodofMatrigelmatrixmembranesimulationextracellularmatrixandthetranswellroom，comparedwiththecellswhichweretransfectedbynegativeplasmidandblankplasmid，analysisstatisticaldatabythemethodofsinglefactoranalysisofvariance(ANOVA)ofSPSS13．0．7TestthechangeoftransferabilityoftumorcellinNudemousebodyDividatotal．of104BALB／Cnu／nufemalenudemouseswhichis4weeksoldintoeightgroupsrandomly,use4#syringetoinjectcellsuspensionattheplaceofcaudalveinwhereis2—3cmdistancefromthetip，O．1mleachmouse。．injectonceagainlweeklater．Putmousestodeath8weekslater．Anatomyinstrictasepticconditions，andtaketheirlungsout．Usesurgerysheartostripa11themetastasisthatcanbecatchedsightunderthemicroscope，weightheweightofthemetastaseswhichhasbeenseparatedwiththeelectronicbalance，recordthedata，analysisstatisticaldatabythemethodofsinglefactoranalysisofvariance(ANOVA)ofSPSS13．0．Results：113-actionfortheinternalreference，inthesebeltsthatwehavegotfromtheexperimentalresults，thebeltofSACC—LMgroupissignificantlybrighterthanSACC-83group，analysisthestatisticaldata,P=0．00<0．05．wecandetect10 英文摘要thatthePPAR丫geneexpressionquantityofSACC-LMcellisobviouslyhigherthanSACC一83cells．2Thereisbrightgreenfluorescencecanbeseenafter48hoursinthesecellsthosehavebeentransfectedbyplasmid．TheresultthatweaculatthetransfectionefficiencyofSACC二LMpositivegroup，SACC-LMnegativecontrolgroup，SACC—LMblankcontrolgroup；SACC一83positivegroup，SACC-83negativecontrolgroup，SACC-83blankcontrolgroupis87．80％，88．02％，86．51％，88．20％，85．3l％，87．76％．ThereiSnosignificantdiferenceamongthesedifferentgroups,P=0．609>0．05．3AfterRNAinterference，inthesebeltsthatwehavegotfromtheexperimentalresults，thebeltsofnegativecontrolgroupissignificantlypalerthanthosecontrolgroups，itsuggeststhat，afterRNAinterference，thePPAR丫expressionquantityofSACC·-LMandSACC--83cellsreducessignificantly．4AfterRNAinterference，thecountofSACC—LMcellsandSACC一83cellsthosegetthroughtheMatrigelartificialbasementmembrantreducessignificantly，仁O．00<0．05．WhilethereisnosignificantdifferenceintheaveragenumberofthecellwhichgetthroughthemembraneinSACC-LMpositivegroupcomparedwimSACC一83group，SACC-83negativecontrolgroupandSACC-83blankcontrolgroup户O．444>0．05．5．Intheeightgroupsofthenudemouses，wehavefoundnointumescentnodulesandlymphnodesintheirbodiesexceptfortheirlungs．ThegroupofSACC—LMwhichisRNAinterferencehasbeenfoundthatthevisiblelungmetastaseshassignificantlyreduced，andthegroupofSACC一83，aftertheRNAinterference，hasnoobviousvisiblemetastasesinthemouses’lungs．Thepulmonarymetastases’averageweightoftheSACC-LMposkivegroupandtheSACC-83positivegrouphassignificantlyreducedcomparedwiththoseofthecontrolgroups，P=O．000<0．05，hassignificantdifference．WhilethereisnosignificantdifferenceontheaverageweightofpulmonarymetastasesoftheSACC—LMpositivegroupcomparedwiththeACC一83group，theSACC-83negativecontrolgroupandtheSACC-83blank 英文摘要controlgroup．P=0．30l>O．05．Conclusion：ThemigrationabilityoftheSACCcellsinvitroandthelungmetastasiswillbereducedsignificantlyaftertheRNAinterference．ConfirmedthatthemetastasisabilityofSACCwillbereducediftheexpressionofPPAR?isinhibited。砀ePPAR7playsanimportantroleinthetransferprocessofSACC，PPAR；ycanbeanewtherapeutictargetforSACC．Keywords：salivaryadenoidcysticcarcinoma；distantmetastases；peroxisomeproliferator-activativedreceptorsgamma(PPART)；cellline；RNAinterference(RNAi)12 研究论文靶向PPARY基因RNA干扰对涎腺腺样囊性癌细胞转移影响的研究舌鲁{鲁刖置RNA干扰(RNAinterference，对忪i)是指在生物体细胞内，内源性或外源性的双链RNA(double．strandedRNA，dsRNA)引起与其同源的mRNA特意性的降解，进而使该目的基因沉默，抑制其基因的表达过程n3，多种体内外实验证实，由21．23个nt组成的短双链RNA能在哺乳动物细胞组织内引起基因封闭的作用乜3，是近几年基因表达调控的热点之一，并已经取得丰硕的成果。涎腺腺样囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcmoma，SACC)是常见地发生于口腔颌面部的恶性肿瘤，发病率在所有涎腺癌中位于第二位，约占所有发生于涎腺的恶性肿瘤的24％，占全部涎腺肿瘤的11％口1，其对周围组织的侵袭能力很强，极易发生远处转移，约40％的该病患者发生远处转移，其中肺转移于该病早期即可出现H1，涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC—LM及涎腺腺样囊性癌肺低转移细胞株SACC．83是经体外和裸鼠体内连续传代培养分离获得的克隆株瞄3，与SACC．83细胞株33．3％的肺转移率相比，SACC．LM细胞株的肺转移率高达85．0％。过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisomeproliferatorsactivatedreceptors，PPAR)在由Isseman阳3等首次发现，是配体依赖性核激素受体超家族成员之一。该受体被其配体激活后可以调控多种基因的转录和表达，参与体内多种生理和病理过程，如血糖调节、脂肪代谢等Ⅲ。近来其与肿瘤间的作用关系已引起越来越多的关注。近年来大量国内外研究表明，PPAR7在许多人癌细胞系中呈高表达，如乳腺癌、脂肪瘤、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌等，部分学者已经着手于PPAR7配体抗肿瘤的临床试验研究。但有关PPAR7及其配体与头颈肿瘤相关的研究极少，其在口腔肿瘤转移中的作用更是尚无全面的观察报道。因此本研究拟采用靶向PPAR7基因RNA干扰的方法，特异性地抑制涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC—LM及肺低转移细胞株SACC．83中PPAR7mRNA的表达，观察该基因表达量的降低对涎腺腺样囊性癌肺 研究论文高转移细胞株SACC．LM及肺低转移细胞株SACC．83体外迁徙能力及裸鼠体内肺部转移成瘤能力的影响，更加深入地研究关于涎腺腺样囊性癌转移的机制及相关因素，进一步完善关于涎腺腺样囊性癌的基因诊断及治疗的分子生物学资料。材料与方法1实验材料1．1细胞株涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC．LM及肺低转移细胞株SACC．83由北京大学口腔医学院口腔外科实验室惠赠。1．2主要实验试剂及耗材RPMI。1640培养基美国Gibco胎牛血清浙江天杭0．25％胰酶美国GibcoG418美国Invitrogen二甲基压枫(DMS0)北京索莱宝细胞裂解液(Trizal)北京索莱宝氯仿北京化学试剂厂异丙醇北京化学试剂厂乙醇北京化学试剂厂焦碳酸乙二酯(DEPC)北京化学试剂厂质粒表达载体武汉晶赛Lipofectamine2000脂质体美国Invitrogen转染试剂盒PPARY引物B．action引物逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒硼酸NazEDTA上海生工美国Thermo天津华东 研究论文NaClKCl琼脂糖溴化乙淀(EB)600bpDNAmarkerBDMatrigel基质胶／基底膜细胞培养瓶、培养板刻度离心管Ep管正压式微孔滤膜滤器(0．22u)细胞冻存管(1．8m1)Transwell小室移液枪头1．3主要仪器和设备：MCO．18AIC二氧化碳培养箱BSC．1500IIA生物安全柜5415D台式离心机PM．10A型倒置显微镜BH2．RFL。T3荧光发射仪BC／BD．518E低温冰箱MDF．V50V超低温冰箱全自动高压蒸汽消毒器202．3AB电热恒温干燥箱微量核酸蛋白检测仪TTICH-400高速低温离心机微型振荡器7901型电磁搅拌器删阿二420数显恒温水箱移液枪VERITIPCR仪DYY-TC型电泳仪天津华东美国Promega美国Sigma美国Thermo美国BD美国Coming上海生工美国Millipore美国Thermo美国BD美国ABGENT日本SANYO济南鑫贝西德国Eppendorf曰本OLYMPUS日本OLYMPUS青岛海尔日本SANYO日本SANYo天津泰斯特美国NanoDrop德国Heraeus上海华光金坛双捷美国Ohaus美国ABI北京六一 研究论文水平电泳槽灌胶和电泳支架凝胶成像分析仪Sartorious电子天平XTZ．03解剖显微镜1．4实验动物北京六一美国BIORAD上海华光上海光学BALB／Cnu／nu裸鼠由北京大学医学部提供，许可证编号SCXK(京)2011-0012。裸鼠4周龄，雌性，14．169。饲养条件保持26．28℃恒温，相对湿度维持于40．60％，笼罩、垫料、饲料、饮水均经灭菌处理。实验饲养全程达无特定病原体(Specialpathogenfree，SPF)条件。2实验方法2．1实验试剂配制2．1．1PBS缓冲液：NaCl89，KCl0．29，Na2HP04-12H201．429，KH2P040．249，加双蒸水至1000ml，高压蒸汽灭菌，200ml无菌瓶分装，4。C冰箱储存备用。2．1．2G418筛选试剂：G418粉剂19溶于PBS缓冲液100ml中，O．22lam微孔滤器过滤除菌，10ml无菌瓶分装，．20。C冰箱储存备用。2．1．35×TBE电泳缓冲液：：Tris碱54．Og，硼酸27．59，0．5mol／1Na2EDTA(PH8．O)20ml，加双蒸水至1000ml，4。C冰箱储存备用。2．1．4l×TBE电泳缓冲液5×TBE电泳缓冲液100ml，加入双蒸水400ml，充分混匀，4。C冰箱储存备用。2．1．51．5％琼脂糖凝胶：琼脂糖1．59，1×TBE电泳液缓冲液100ml，微波炉加热2分钟，置室温，约60。C，加TB5u1，倒入制胶架中，加入点孔梳，室温冷却后拔出梳子，取出胶体备用。2．2细胞培养人涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC．LM及肺低转移细胞株SACC．83，用含10％热灭活胎牛血清不含抗生素的RPMI。1640培养基， 研究论文于37℃、5％C02孵育箱中培养。培养过程中，处于对数生长期的细胞，用0．25％胰酶消化2-3min，用含10％热灭活胎牛血清不含抗生素的RPMI一1640培养基终止消化，低速离心机离心，1000rpm，5min，弃上清，加含10％热灭活胎牛血清不含抗生素的RPMI．1640培养基，反复吹打制成细胞悬液，镜下计数调整细胞浓度，接种到新的培养瓶，整个过程中严格无菌操作，每天观察细胞生长情况。2．3细胞的冻存选择指数生长期的细胞，用0．25％胰酶消化，用含10％热灭活胎牛血清不含抗生素的RPMI一1640培养基终止消化，低速离心机离心，1000rpm，5min，弃上清，加入冻存液(10％胎牛血清、lO％DMSO、80％RPMI．1640)，以2×106／ml的密度悬浮细胞。将细胞悬液转移至冻存管，置入冻存盒，4。C冰箱放置30分钟，．20。C放置3小时，．80℃冰箱放置12．24小时，移入液氮罐中长期保存。2．4冻存细胞的复苏液氮罐中取出冻存管，迅速放入37。C水浴，轻轻摇动使其尽快融化。用无菌吸管吸出细胞悬液，移至离心管中，加入10倍培养液，混匀后1000rmp离心5min。弃上清，用含10％热灭活胎牛血清不含抗生素的RPMI．1640培养基悬浮沉淀细胞，接种于培养瓶中，37。C、5％C02孵育箱中培养。2．5R1ⅦCR(逆转录一聚合酶连反应)检测两细胞株PPARl,基因表达差异2．5．1Trizol一步法从细胞中提取总RNA2．5．1．1分别将80"～90％汇合的生长状态良好的SACC—LM细胞及SACC．83细胞弃培养基后按lml／10cm2直径培养皿贴壁细胞加入Trizol，反复吹打至液体完全透明，室温放置10rain；2．5．1．2按0．2mL氯仿／lmlTrizol的量加入氯仿，震荡30s，室温放置2-3min，4。C离心，12000rpm，15mira2．5．1．3取上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃离心，12000rpm，10mira2．5．1．4弃上层水相，75％乙醇lml，洗涤RNA沉淀，4。C离心，7500rpm，5min；2．5．1．5室温干燥RNA沉淀5—10min，适量RNase-freeH20溶解RNA。 研究论文2．5．1．6微量核酸蛋白检测仪测定RNA吸光度，并确定RNA浓度。2．5．2RT逆转录RT-PCR所用引物如下(引物由上海生物工程技术公司进行合成)。稀释样品使各样本的RNA浓度大致相等，按照试剂盒的说明书进行RNA的逆转录，具体如下：总RNA0．5蚓旺OligodTRNase—freeH205gg1gl适量酬Jl12山65℃5min．土置冰上5min，上短暂离心，加入以下试剂J10mMdNTPMix2gl5xbuffer4glRNaseinhibitor(40U／91)lul 研究论文M-MLV(200U／旺)1山Total20“l上混匀，短暂离心，42。C，60min上70。C，5min，冰上5min，取29l进行PCR2．5．3PCR扩增将10D上下游引物分别使用RNase．freeH20配成100uM的储液，37。C溶解，上下游引物各取1p1分别稀释到10山中，取l“1进行PCR反应，体系如下：cDNA2glPCRMasterMix(2×)lOm上游引物1斗l下游引物l“lRnase-freeH206gl’№tal20山在PCR仪上进行扩增反应：反应程序设置如下：95℃预变性5min--专94℃变性45s_56℃退火45s一72℃延伸45s，共27个循环一72℃延伸10min。2．5．4电泳及检测取扩增产物89l，按设计加入上样孔内，行1．5％琼脂糖凝胶电泳，并凝胶成像分析仪照相。’2．6确定G418最佳筛选浓度按照试剂盒说明，需根据G418对肿瘤细胞的杀伤毒性确定G418筛选的最佳筛选浓度及最佳维持浓度。将SACC．LM及SACC．83细胞均接种于24孔板，细胞密度确定为2×105／孔，加入含10％灭活胎牛血清不含抗生素的RPMI．1640培养基，常规培养24h，向各孔内依次加入G418溶液，使1。10孔的G418浓度分别确定为100lag／ml、200pg／ml、300ug／Inl、400ug／111l、500ug／ml、600pg／ml、700ug／ml、800pg／ml、900pg／ml、100011g／ml，继续常规培养， 研究论文每浓度设计平行对照3孔，每3天更换一次培养液，维持上述各孔G418浓度，每目观察细胞生长情况，可见细胞成批性出现结构破坏、死亡并漂浮，培养2周，以全部细胞被杀死的最低G418浓度为最佳筛选浓度。最终确定最佳筛选浓度为800ug／ml，最佳维持浓度为400lag／ml。2．7PPAR7基因siRNA表达载体的构建根据人PPAR7序列[该序列来自于Genbank，NM13871l，Homosapiensperoxisomeproliferativeactivatedreceptorgamma(PPARy)]转录RNA的位置，依据小分子干扰RNA(smallinterfering，siRNA)的设计原则，由武汉晶赛公司设计了3个靶位点：——、aagacaacctgctacaagccc，442—462；二、aatcaaagtggagcctgccatc，505—525；三、aagacaacctgctacaagccc，1503-1523。针对上述靶位点合成了3对寡核苷酸片段：片段一：5’-GATCCGAACAGATCCAGTGGTTGCTTCAAGAcGGCAACCACTGGATCTGTTCTTTlvrTGTCGACA-3’，3’-GCTTGTCTAGGTCAcC从CGAAGTTCTGCCGTTGGTGACCTAGACRAGAAAAAACAGCTGTTCGA一5’：片段二5’-GATccGTcA^^GTGGAGcCTGcAT∞Tc“GAoGGATGcAGGcToCAClvrTGATTTT订GTCGACA．3。3’-GCAGTTTCACCTCGGACGTAGAAGTTCTGCCTACGTCCGAGGTGAAACTAAAAAACAGCTGTTCGA一5‘：片段三5’-GATCCGACAACCTGCTAC从GCCC’邝CAAGACGGGGCTTGTAGCAGGTTGTClvrTTTTGTCGACA_3’，3’一GCTGT7rGGACGATGTTCGGlGAAGTTCTGCCCCG从CATCGTCC从CAGAAAAAACAGCTGTTCGA一5’：交由武汉晶赛公司构建PPARy基因siRNA表达载体，选取与PPARy基因同源性较差的序列作为阴性对照，构建阴性对照载体，最后将U6启动子序列按照Genbank序列(ACCessionnumberX06980)体外化学合成后克隆到PPARy基因siRNA表达载体，替代原有的启动子，最终获得所需的siRNA表达载体，同时以空质粒作为空白对照。构建的载体质粒分别称为：pcDNA-SACC．Xa(阳性干扰质粒)，pcDNA-SACC．Xn(阴性对照质粒)，pcDNA．SACC-X(空白对照质粒)。 研究论文2．8转染2．8．1按Invitrogen的产品说明将阳离子脂质体Lipofectamine2000和质粒表达载体分别加入250ul不含胎牛血清及抗生素的RPMI．1640培养基内稀释，将二者混匀，室温放置20分钟，使形成阳离子脂质体Lipofectamine2000．质粒表达载体的复合体。2．8．2将对数生长期的SACC．LM细胞及SACC．83细胞分别接种于六孔板中，每孔细胞计数为2×105个，常规培养24h过夜。此时细胞融合程度已达80％左右，将六孔板内的培基吸出，用不含胎牛血清及抗生素的RPMI．1640培养基清洗一次，分别向六孔板孔内加入不含胎牛血清及抗生素的RPⅦ．1640培养基1．5ml，分别加入阳离子脂质体Lipofectamine2000．质粒表达载体复合体500l-tl，常规培养。2．8．3转染4h后，吸出六孔板内的复合体、培基混合液，再加入含10％胎牛血清不含抗生素的RPMI．1640培养基，继续常规培养，将转染阳性质粒、阴性对照质粒及空白质粒的SACC—LM细胞及SACC．83细胞分别命名为：SACC．LM阳性转染组、SACC．LM阴性转染对照组、SACC．LM空白转染对照组，SACC．83阳性转染组、SACC．83阴性转染对照组、SACC．83空白转染对照组，每组设平行对照6孔。2．9镜下观察质粒转染情况转染48h后，从培养上述转染后的各组细胞的各组孔内每组分别随机选出六个视野，置于荧光倒置显微镜下观察各组细胞质粒转染情况，记录实验数据，应用SPSS13．0软件单因素方差分析法(ANOVA)进行统计学处理。2．10RT-PCR检测PPAR7基因干扰效率。．转染48h后，分别收集各组部分细胞，应用RT-PCR技术检测各组细胞转染后PPAR7基因表达情况(具体方法同上述)，其余细胞用于筛选。2．11G418筛选建立稳定的PPAR7基因干扰细胞株向上述培养转染后细胞的六孔板各孔内分别加入G418，最终G418浓度确定为800u幽：111进行阳性克隆筛选，72h后各组均可见大量细胞漂浮死亡，继续用G418维持浓度400t．tg／ml进行培养，每隔3天更换一次培养液，2周后将上述筛选出的阳性克隆接种于培养瓶中继续扩大培养，4001．tg／mlG418维持。 研究论文2．12Transwell小室检测SACC细胞体外迁徙能力改变将Transwell培养板上室用无菌小镊子取出，取Matrigel(3ug／u1)20pl放于上室的聚碳酸酯膜上，放置37。C，60min，使Matrigel凝聚成胶。选择处于对数生长期的的未转染、转染阴性对照质粒、空白对照质粒及阳性抑制质粒的SACC．LM及SACC．83细胞，PBS冲洗三次，常规消化，用不含胎牛血清及抗生素的RPMI．1640培养基制成单细胞悬液，细胞计数，台盼蓝染色法检测细胞活率，确定细胞活率大于95％。各上室孔中加入细胞5×105个／孔，约100ul，再加入不含胎牛血清及抗生素的RPMI．1640培养基200ul，每组细胞做六孔，下室中加入含10％胎牛血清不含抗生素的RPMI．1640培养基500ul，将Transwell培养板置于5％C02、37。C培养箱中培养24h。小镊子小心取出上室，弃上室培基，将未穿过Matrigel人工基底膜的细胞用湿棉签小心的擦掉，将上室浸于甲醛中室温下固定30min，将固定好的聚碳酸酯膜用15号手术刀片小心取下，平整的放于载玻片上，镜下观察，计数每组细胞穿过膜的细胞数，每组六张膜，每张膜上随机取1个视野，各组共计6个视野，计数细胞数量，取平均值。本步实验重复3次，记录实验数据，应用SPSS13．0软件单因素方差分析法(ANOVA)进行统计学处理。2．13裸鼠体内检测SACC细胞肺转移能力的改变选择指数生长期的未转染SACC．LM、SACC．83细胞，PBS缓冲液冲洗3次，0．25％胰酶消化，加生理盐水制成单细胞悬液，细胞数调节至lX107／ml，经台盼蓝染色，确认活细胞率达95％以上。转染阳性干扰质粒pcDNA．SACC．Xa，、阴性对照质粒pcDNA．SACC．Xn及空白对照质粒pcDNA．SACC-X的SACC．LM、SACC．83细胞的细胞悬液制备同上。4W龄雌性BALB／Cnu／nu裸鼠，105只，其中1只不经任何处理，用于对照，剩余104只随机分成为8组，分别命名为：SACC．LM组、SACC．LM阳性转染组、SACC．LM阴性转染对照组、SACC．LM空白转染对照组，SACC．83组、SACC．83阳性转染组、SACC．83阴性转染对照组、SACC．83空白转染对照组。在无特殊病原菌条件下饲养。将裸鼠放入固定容器中固定，4号注射器于距尾静脉尖2-3cm处尾静脉注入细胞悬液O．1ml／只，注射前注意将细胞摇匀，整个过程严格遵守无菌原则。1W后重复注射一次。 研究论文8W后将裸鼠处死，严格无菌条件下解剖，取出肺脏。在显微镜下用手术剪剥离所有肉眼可见转移灶，将分离的转移灶用电子天平称重并记录，应用SPSS13．0软件单因素方差分析方法进行统计学数据处理。将部分上述肿瘤肺转移灶用10％福尔马林固定，石蜡包埋后51am连续切片，HE染色观察。结果lRT-PCR验证两细胞株PPARy基因表达量的差异以13-action为内参，实验结果所得到的两组条带中SACC．LM组条带明显较SACC．83组明亮(Fig．1)，所得数据经统计学分析，结果显示：P=0．00<0．05，有显著差异，说明SACC．LM细胞株的PPARy基因表达量高于SACC．83细胞株(Fig．2)。2镜下观察质粒转染情况转染48h后荧光倒置显微镜下观察转染质粒的各组细胞的转染情况发现，成功转染质粒的细胞中均可见明亮的绿色荧光(Fig．3)，各组分别取六个视野计数成功转染质粒细胞的数量，计算得出SACC．LM阳性转染组、SACC-LM阴性转染对照组、SACC-LM空白转染对照组，SACC一83阳性转染组、SACC．83阴性转染对照组、SACC一83空白转染对照组各组细胞转染效率分别为87．80％、88．02％、86．51％，88．20％、85．31％、87．76％，各组质粒转染效率比较，P=-0．609>0．05，无显著差异(Table1)。3RT-PCR验证RNA干扰后两细胞株PPARy基因表达量的改变以13．-action为内参，检测转染48h后SACC．LM及SACC．83细胞株中PPARy基因表达量的改变，同时以阴性转染对照组及空白转染对照组作为对照，并与未转染细胞RT-PCR所得条带进行比较，RT-PCR结果显示，转染阳性干扰质粒pcDNA．SACC．Xa实验组的细胞所得条带较其他三组对照组相比明显变暗，而三组对照组条带亮度相近，说明转染阳性干扰质粒的细胞中PPARy基因表达量较未转染及转染对照质粒的细胞PPARy基因表达量显著降低(Fig．4)。4Transwell小室检测肿瘤细胞体外迁徙能力改变用Matrigel基质膜模拟细胞外基质及Transwell小室检测细胞特异性 研究论文PPARy基因干扰沉默后SACC．LM及SACC．83细胞株粘附迁徙能力的改变，同时以未转染细胞、转染阴性对照质粒及空白对照质粒的细胞做对照。实验重复3次，取平均值。结果示转染阳性干扰质粒pcDNA．SACC．Xa实验组穿膜细胞数均值与其他三组对照组相比明显减少，P=-0．00<0．05，存在显著差异，而SACC．LM阳性转染组细胞穿膜数量均值与SACC．83组、SACC．83阴性转染对照组及SACC．83空白转染对照组相比P=-0．444>O．05无显著差异(Table2)。5裸鼠体内SACC细胞肺转移能力的改变未转染质粒的SACC．LM、83细胞及转染后的细胞均经裸鼠尾静脉注射入裸鼠体内，注射后每隔2．3天观察一次裸鼠的状态，观察过程中，部分裸鼠活动能力逐渐减弱，消瘦，精神萎靡，未见死亡。8W后处死裸鼠，肉眼可于肺部见转移灶情况，并与正常裸鼠肺脏相比较(Fig．5、6、7、8、9、10、11、12、13)，显微镜下解剖取出肺脏，分离肺部肿瘤转移灶并称重。8组裸鼠体内除肺以外，其他部位均未发现结节及淋巴结肿大。SACC—LM组经PPARy基因沉默干扰后的细胞株裸鼠体内的肺部转移灶在肉眼下明显减少、变小，且SACC．83组经PPAR7基因干扰后的细胞株裸鼠体内的肺部在肉眼下观察无明显可见转移灶。SACC．LM阳性转染组、SACC．83阳性转染组细胞裸鼠体内肺转移灶重量均值与各自对照组细胞株相比显著减轻，P=-0．00<0．5，有显著差异，而SACC-LM阳性转染组细胞裸鼠体内肺转移灶重量均值与SACC．83组、SACC．83阴性转染对照组组及SACC．83空白转染对照组相比，P=0．301>O．05，无显著差异(Table3)。取部分肺肿瘤转移灶切片，HE染色(Fig．14、15)，通过病理诊断证实。 研究论文附图13●∞or■。-_●o巴∽》oIoo乙o∽》onIP蓉Fig．1TheexpressionofPPARYinSACC—LMandSACC-83cellsanalysedbyRr-PCR0．5O．40．30．20．1O，i强一乒。0一蠢学誊i葺、．+’擘冀“二jl；o。。。。r。。。攀≥v■。+’奠z蓦、。⋯^，÷囊isjW蒜警#．}。一、i。⋯：i二，一jj学奠薯。芝7i薯曩_。‘。蠢■o麟Ⅵ7、。。7j。‘一⋯⋯：⋯．誊j。7、‘?j誓0譬萋薹黧誊oi，：。i。i毫鬟麓尊二．0：，-二。i·i{≮jj蔓稿。一。i、!毒i’“冀一∞、、1：■。、^，jI；、囊鬟蠢鬻虢、毒≥鬻赢；誊簿蠢?魏#≈％i《i≮i’，。t。∞m?。、&一一l囹ACC—LMI，：鬻荔餐i爹j一．婆。i，一’、～i0q’j5一=囊、．。{，?v甜。|群1；}{I鬻=x。I|∥。^*_一『：1tci{。“≈≮l●ACC一83I‘．。篱。一■。一j⋯“々、蒸鬻瓣攀ii瀵疆譬§．i。’’。‘-、。童。。簟，I_I⋯”蓊麓ijj：骥i、i冀鬻、；≯簿鎏。|嚣：簿1；1萋鬻鏊“羹”“j≥。≯z|耋冀v。t。一。，．蒜|i。尊专|≥‘j。。¨1·⋯％_‘j跳蝌，、 研究论文13I∞o一■_●●o巴∽》ol∞阴性组∽》oI妄阴性组∽》ol∞阳性组∽》oI广墨阳性组∽言olI∞广∞暑空白组Fig．3TheexpressionofPPARYinSACC-LMandSACC一83cellsaftertransfectedbyplasmidsanalysedbyRT-PCRFig．4TherehasgreenfluorescenceCanbesawinthesecellswhichhavebeentransfectedsuccessfully26 研究论文Fig．5InSACC—LMgroup，therehasprominentmetastasescanbefoundinthelungsofnudemitesFig．6InSACC·LMnegativecontrolgroup，therehasprominentmetastasesCanbefoundinthelungsofnudemites 研究论文Fig．7InSACC—LMblankcontrolgroup，therehasprominentmetastasescanbefoundinthelungsofnudemitesFig．8InSACC-LMpositivetransfectiongroup，itCanbefoundthatthemetastasesoflungshasreducedandbecamesmaller 研究论文Fig．9InSACC一83group，themetastasesinlungsofnudemicesalesmallandlessFig．10InSACC一83negativecontrolgroup，themetastasesinlungsofnudemicesalesmallandless 研究论文Fig．11InSACC一83blankcontrolgroup，themetastasesinlungsofnudemitesaresmallandlessFig．12InSACC-83positivetransfectiongroup，therehasnoobviousmetastasescanbefoundinlungsofnudemites 研究论文Fig．13ThenormallungofnudemiceFig．14Themetastasesinthelungofnudemouse，stainedbyHE×203l 研究论文Fig．15Themetastasesinthelungofnudemouse，stainedbyHE×4032 研究论文附表Table1Comparisionofthetransfectionrateofdifferentplasmids组别质粒转染效率(％)SACC—LM阳性SACC—LM阴性对照SACC-LM空白对照SACC-83阳性SACC-83阴性对照SACC一83空白对照87．80±1．73488．02±2．69886．5l±2．79588．20±2．39485．31±5．15587．76±3．564Thestatisticalanalysisshowthatthereisnotsignificantlydiferenceamongthedifferentgroups，仁O．609>0．0533 研究论文Table2TheinfluencefortheabilityoftheSACCcellsthroughthemembraneinvitroafterPPARYhasbeeninhibited组别穿膜细胞数SACC—LMSACC-LM．阴性对照SACC-LM．空白对照SACC．LM．阳性SACC．83SACC．83．阴性对照SACC．83．空白对照SACC．83．阳性150．66674-1．64385153．2800士2．85154l52．1667士1．8350062．8333士2．7537966．5000士1．5000066．3333士3．7097564．8333士3．3841l30．8333士1．76132Thestatisticalanalysisshowedthatthepositivegroupcomparedwitlltheirrespectivecontrastgroups，thenumberofthecellwhichthroughthemembraneissignificantlyreduce，P=-0．00<0．05；SACC-LMpositivegroupcomparedwithSACC一83group，SACC一83negativecontrolgroup，SACC一83blankcontrolgroupthenumberofthecellwhichthroughthemembraneisnotsignificantlydifference．胆O．444>0．0534 研究论文一一————_————————————_————_—————————————————————_—————————————————————一Table3TheinfluencefortheabilityofpulmonarymetastasisnofSACCinnudemiceafterPPARYhasbeeninhibitedSACC．LM13120．4922_0．0114092．31％SACC．LM．阴性对照13SACC．LM一空白对照13SACC-LM-阳性SACC．83131011450．457l±0．012290．4487±0．006390．1808±0．011240．1842±0．00736SACC．83．阴性对照1340．1848i-0．00618SACC．83．空白对照135O．1756i-0．065076．92％84．61％30．77％38．46％30．77％38．46％ThestatisticalanalysisshowedthattheSACC—LMpositivegroup，SACC一83positivegroupcomparedwiththeirrespectivecontrastgroupstheaverageweightofpulmonarymetastasessignificantlyreduce，户O．00O．05—————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一一35 研究论文讨论侵袭性和转移性是恶性肿瘤的本质特征，腺样囊性癌是发生于涎腺的最常见的恶性肿瘤之一，也是头颈部极易经血运发生远处转移的恶性肿瘤，其远处转移主要发生于肺部。恶性肿瘤的转移过程通常是由包括侵袭肿瘤周围组织，沿顺血液及淋巴系统的运行、在靶器官上大量增殖等步骤组成，恶性肿瘤的转移是多基因共同参与的复杂过程，如果恶性肿瘤失去其自身的转移能力，那它的恶性程度将会极大地降低，目前尚没有一个明确的结论能全面地解释恶性肿瘤的侵袭及其转移现象，针对恶性肿瘤转移相关基因及其机制的研究已经成为医学科学工作者尝试攻克肿瘤的热门途径，并取得了一定的成果，其中应用RNA干扰(砌蛆i)技术研究肿瘤转移相关基因及其机制已经成为一个主要的研究方向，并取得了一定的成果。RNA干扰(对妊i)是一种古老的，跨越着多种种属的生物途径，是生物细胞的一种内免疫防御的机制，它的存在能够保护生物细胞自身的基因组免于来自于外界的侵袭性双链RNA(dsRNA)的损害，起到维持自身基因组稳定性的作用，RNAi是Jorgensen阳1在转基因植株中首先发现的，并被他称之为共抑制。后继的相关研究发现RNAi在生物界广泛存在。Fire等阳11998年在线虫体内进行反义核苷酸相关研究时发现双链RNA(dsRNA)能使有互补序列的内源性基因得到有效的抑制，且效果比单链反义RNA好，在此基础上提出了双链RNA诱导的RNA干扰。1999年，科研工作者在多种哺乳动物体内也发现了RNAi现象的存在。2001年，Elbashir等n们通过其实验进一步证实了RNAi存在于哺乳动物细胞中，从此人们开始了各种哺乳动物细胞RNAi相关的研究。Harborth等n妇在实验中，利用RNAi技术特异性的沉默细胞骨架蛋白基因，发现细胞生长受到明显的影响，该实验证明细胞骨架蛋白为细胞生长不可缺少的，进而表明了RNAi技术在分析哺乳细胞基因功能中的价值。RNAi是通过导入与内源基因相同的一段双链RNA(dsRNA)，降解内源mRNA，使细胞表现出特定基因缺失表型，达到抑制目的基因表达的目的，为一种序列特异性转录后基因沉默n2删。Zeng等n61通过使用逆转录病毒Rev／RRE系统在人体细胞中研究发现，RNAi只能作用于存在于细胞之中和正在出核运转过程 研究论文中的目标mRNA，对存在于细胞核中的mRNA或者pre．mRNA无作用。根据目前的相关研究，RNAi的分子机制可以概括为三个步骤：(1)小干扰RNA(siRNA)的形成，(2)siRNA结合RNA沉默诱导复合物(ⅪSC)，特异性的降解靶RNA，(3)新形成的siRNA可以作为新的引物，通过RNA依赖的RNA聚合作用产生新一轮的同源性mRNA的降解，扩大RNAi的信号，使基因表达的抑制作用显著增强。Brummelkamp等n刀在实验中检测到针对内源性肿瘤侵润抑制因子1(CDH1)基因突变体构建的siRNA对CDH1基因无抑制作用，证实了siRNA作用具有特异性。RNAi降解特异性mRNA体现着5个重要特点n引：(1)该过程是转录后基因沉默，不受翻译抑制剂的影响，(2)特异性高，(3)高效，(4)可传递性(5)时间和浓度的双重依赖性。与反义核苷酸治疗、细胞因子基因治疗、基因替代等方法相比，RNAi的优势不可比拟。RNAi抑制作用强、准确、稳定性高、细胞摄取容易，这些优点使其在基因功能研究、抗病毒基因治疗机抗肿瘤等领域均得到了广泛的应用n争22J。目前RNAi技术应用于肿瘤方面的研究主要集中在以下几个方面：(1)通过转录后产生的基因沉默效应作用于癌基因或抑癌基因，研究对肿瘤生长的影响，(2)将产生的基因沉默效应间接的作用于肿瘤相关基因，进而研究肿瘤的发病机理，以期确定新的肿瘤治疗靶点，找到全新的、快速有效的研究方法，(3)筛选、鉴定肿瘤的易感基因，(4)针对肿瘤合成特异性的siRNA，直接用于肿瘤的治疗。晰lda等瞳31在其实验中向K562白血病细胞中转染特异性dsRNA，使BCR／ABL融合位点受到沉默，发现BCR／ABL融合基因的mRNA和蛋白的表达水平降低，并引起细胞凋亡。Wang等瞳们的实验发现，应用RNAi技术特异性的抑制人肝癌细胞系BEL．7402的细胞周期正向调节因子l(CyclinE1)能够使肿瘤细胞停止生长。Harvey等瞳51在实验中应用RNAi技术特异性的抑制Brk蛋白的表达使乳腺癌细胞的增生受到明显抑制，同时发现Brk的无激酶活性突变体能够以接合器的形式，通过相关机制使肿瘤细胞的生长活性得到加强，该实验结果表明Brk能够成为治疗乳腺癌的新靶标。Wlilliams等瞳61在实验中应用RNAi技术及eDNA芯片技术成功的鉴定出了多个与结肠癌高度相关的基因。Song等乜71在动物实验中给自身免疫性肝炎小鼠模型通过尾静脉注射基于Fas基因构建的siRNA发现，鼠肝细胞内Fas蛋白及mRNA的表达降低，10天后82％接受RNAi治疗的小鼠 研究论文肝细胞恢复正常，而未接受RNAi治疗的小鼠40％在3天内死亡。RNAi技术是一个全新的科研领域，为基因功能的研究提供了一个高效的方法，为病毒性疾病及肿瘤的治疗带来了新的希望，经过近十几年的发展，RNAi技术已经趋于成熟。恶性肿瘤的转移是一个复杂的过程，如果肿瘤细胞生长过程在某个或多个阶段受阻，肿瘤细胞的生长及转移将受到抑制。RNAi技术能够在基因水平作用于肿瘤细胞生长的某个或多个阶段，进而特异性的阻断肿瘤细胞的生长及转移。过氧化物增殖体激活物受体(peroxisomeproliferatorsactivatedreceptors，PPAR)是最新发现的一组核激素受体，它与甲状腺激素受体、类维生素A受体、类固醇激素受体、及维生素D受体一样，均属于核激素受体，亦被称为脂肪酸受体。PPAR7作为人类PPAR的三种亚型之一，目前研究已经比较广泛。人类PPAR7主要表达于脂肪组织，除脂肪组织外，在人体中的巨噬细胞及其他脂肪储存细胞，如：肝、肾、肺等中均有表达，PPAR7的主要表现形式是PPARyl，表达范围广泛，PPAR丫参与糖尿病、动脉粥样硬化、炎症、肥胖等的病理生理过程并发挥重要作用。目前，在人类口腔颌面部、呼吸系统、消化系统、生殖系统等的恶性肿瘤中均发现PPAR7的表达，其表达量的高低与肿瘤的恶性程度及转移与否存在着关系。PPARy有上百种人工合成配体及天然配体，并且部分配体已经应用于临床，针对PPARy及其配体的研究已经趋于成熟。由自然配体或药物配体激活的PPAR3,激活体既可以产生细胞增殖的抑制作用，又有可能诱导细胞凋亡或终末分化作用，PPARy活化后能够抑制肿瘤的发生的机制可能主要涉及到引起肿瘤细胞的细胞周期停滞于G1／G2期，诱．导细胞分化，抑制肿瘤血管生成，诱导肿瘤细胞的凋亡等环节。因其表达量的高低与肿瘤的恶性程度及转移与否存在着关系，PPAR?已经成为肿瘤的基因治疗研究中一个较为成熟的靶点，针对其的相关研究亦已比较丰富，但关于PPAR?与口腔癌生物学行为相关性研究尚不多见，具体机制尚不清楚。相关研究表明，涎腺腺样囊性癌中存在PPARy的表达，并且在涎腺腺样囊性癌肺高、低转移细胞株SSCC．LM、SACC．83中PPARy的表达存在显著差异，其中肺高转移细胞株SSCC．LM的PPAR7基因表达量明显高于肺低转移细胞株SACC．83。既然SACC肺高、低转移两种细胞株表 研究论文现的生物学特性存在上述差异，我们推测PPAR3,基因很可能与SACC的转移有直接或间接的关系。RNAi技术因其高效性、特异性、准确性、可传递性及其在哺乳动物体内一致存在的特性已经得到了全球范围科研领域的一致认可，并成为目前小分子基因水平研究中的一种重要的研究手段，其研究结果具有较强的说服力及很高的认可度。目前，将RNAi技术应用于口腔癌生物学行为相关的研究尚不多见，其中刘晓华等瞳81在他们的实验中应用RNAi技术成功地特异性地使涎腺粘液表皮样癌Mc3细胞中HER2基因的表达受到抑制，表达量显著降低，是目前少数的几个将RNAi技术应用于口腔癌研究的学者之一，他们实验的成功表明，RNAi技术同样可以应用于口腔癌生物学行为相关的研究。PPARl,作为一种最新发现的核激素受体，已经被证实参与人类多种疾病的发生、发展及预后的过程，大量体内外实验表明PPARl,的激活或抑制能够影响多种肿瘤细胞的生长，但是激活或抑制PPARl,基因的表达对肿瘤转移能力的影响的研究目前还不多，关于PPARl,基因在El腔癌的发生、发展中的作用的研究更少，关于PPART基因与SACC转移相关方面的研究目前还没有。本实验通过应用RNA干扰(RNAi)技术，异性地抑制SACC肺高、低转移细胞株中PPARl,mRNA的表达，对PPAR3'基因与SACC转移相关进行了研究，目的在于研究PPARl,基因与SACC转移的相关性，丰富关于SACC治疗的小分子水平的研究，以期为SACC的基因治疗找到新的靶点。本实验首先应用RT-PCR方法检测，证实SACC．LM细胞株中PPARTmRNA的表达量明显高于SACC．83。根据基因干扰片段设计原则及方法，设计了针对涎腺腺样囊性癌PPAR3,基因的特异性干扰片段，严格按照转染试剂的操作说明，转染实验组细胞株，将未转染及转染的细胞株分别命名为：SACC—LM组、SACC．LM阳性转染抑制组、SACC．LM阴性转染对照组、SACC．LM空白转染对照组，SSACC．83幺且、SACC一83阳性转染抑制组、SACC．83阴性转染对照组、SACC．83空白转染对照组，在荧光倒置显微镜下观察可见质粒转染成功的细胞内可见明亮的绿色荧光，并通过计算得出SACC．LM阳性转染组、SACC—LM阴性转染对照组、SACC．LM空白转染对照组，SACC．83阳性转染组、SACC．83阴性转染对照组、SACC．83空白转染对照组各组细胞转染效率分别为87．80％、88．02％、 研究论文86．51％，88．20％、85．3l％、87．76％，各组质粒转染效率比较，P=0．609>O．05，无显著差异。应用RT-PCR技术验证了经RNA干扰后，上述两细胞株的PPARymRNA的表达量明显降低，说明设计的干扰片段有效，起到了针对涎腺腺样囊性癌PPAR3,的基因特异性“沉默”的作用。通过体外迁徙能力实验，我们发现不论涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株SACC．LM还是涎腺腺样囊性癌肺低转移细胞株SACC．83，其阳性转染抑制组穿过Matrigel基质膜的细胞数均值与其他三组比较，P=0．00<0．05，存在显著差异，说明经RNA抑制后SACC．LM细胞株及SACC．83细胞株的体外迁徙能力均明显降低，而SACC．LM细胞株阳性转染组细胞穿膜数量均值与SACC一83组、SACC．83阴性转染对照组及SACC．83空白转染对照组相比P=0．444>0．05无显著差异，说明经RNA抑制后SACC．LM细胞株的体外迁徙能力接近SACC．83细胞株。在裸鼠体内建立的肺转移模型中我们发现，SACC—LM阳性转染抑制组、SACC．83阳性转染抑制组细胞裸鼠体内肺转移灶重量均值与各自对照组细胞株相比显著减轻，P=-0．00<0．05，有显著差异，说明经砌蛆抑制后SACC．LM细胞株及SACC．83细胞株的裸鼠肺转移能力均明显降低，而SACC．LM阳性转染组细胞裸鼠体内肺转移灶重量均值与SACC一83组、SACC．83阴性转染对照组及SACC．83空白转染对中组相比，P=-0．301>O．05，无显著差异，说明经RNA抑制后SACC．LM细胞株的裸鼠肺转移能力接近SACC．83细胞株。本实验证实：PPARy基因的“沉默”能够使SACC细胞的体外迁徙能力及在裸鼠体内肺转移能力受到明显影响，造成这种影响的机制可能是：针对PPARy基因设计的的特异性siRNA转染SACC细胞株后使与PPARy基因同源的mRNA发生降解，造成PPARy基因失活、PPART蛋白表达降低，使SACC细胞的转移能力降低。通过本次实验的结果可见PPAR3,基因表达的高低、与否对SACC细胞株的生物学行为产生了显著的影响，说明PPARy基因参与SACC的转移过程，并在该过程中发挥重要作用。但是，SACC转移过程不可能只是单纯地依赖PPAR7这一种基因，那PPARy基因在SACC转移过程中哪个或是哪几个环节起作用?具体的作用途径是什么?我们都还不清楚，需进行进一步研究。 研究论文结论1PPAR7mRNA在SACC．LM细胞株中的表达量明显高于SACC．83细胞株，进一步证实PPAR7可能与SACC的转移相关。2特异性PPAR7基因RNA干扰后，SACC。LM细胞株及SACC．83细胞株体外迁徙能力及裸鼠肺转移能力均显著降低，且SACC．LM细胞株经RNA抑制后体外迁徙能力及裸鼠肺转移能力均接近SACC．83细胞株，说明特异性地抑制SACC细胞株PPARy基因的表达能够减低其转移能力，证实了，PPAR7基因在SACC转移方面发挥重要作用，PPAR7有可能成为治疗SACC的新的靶点。参考文献1FireA，XuS，MontgomeryMK，eta1．Potentandspecificgeneticinterferencebydouble．strandedRNAinCaenorhabditiselegans．Nature，1998，391(6669)：806．8112KuGMcManusMT．BehindthescenesofasmallRNAgene—silencingpathway．HumGeneTher,2008，19：17—263张震康，俞光岩．口腔颌面外科学(北京大学医学教材)．北京：北京大学医学出版社，2007：388．3894SungMWKK，kimJW：eta1．：Clinicopathologicpredictorsandimpactofdistantmetastasisfromadenoidcysticcancinomaoftheheadandneck．ArchOtolamgolHeadNeckSurg2003．129：1193．11975李盛琳，刘绣屏，章魁华．人腺样囊性癌(SACC一83)细胞系的建立及其生物学特性．中华口腔医学杂志，1990，25(1)：29．316IssemannI．GreenS：ActivationofaMemberoftheSteroid．HormoneReceptorSuperfamilybyPeroxisomeProliferators．Nature1990，347(6294)：645--6507CraftSWG：Insulinandneurodegenerativedisease：sharedandspecificmechanisms．LancetNeurol，2004，3(3)：169．1788JorgensenR．Alteredgeneexpressioninplantsduetotransinteraction41 研究论文betweenhomologous．TrendsBiotechnol，1990，8：340—3449FireA，XuS，MontgomeryMK，eta1．Potentandspecificgeneticinterferencebydouble—strandedRNAinCaenorhabditiselegans[J]．Nature，1998，391(6669)：806-8110ElbashirSM，HarborthJ，LendeckelW：eta1．Duplexesof21一nucleotideRNAsmediateRNAinterfenceinculturemammaliancells[J]．Nature，2001，411(6836)：494—49811HarborthJ，ElbashirSM，BechertK，eta1．IdentificationofessentialgenesinculturedmammalianCellsusingsmallinterferingRNAs[J]．JCellSci，2001，114(Pt24)：4557—456512WildaM，FuchsU，WossmannW：eta1．KliilingofleukemiccellswithaBCR地LfusiongenebyRNAinterference(RNAi)．Oncogene，2002．,21：5716—572413McCaffreyAP,MeuseL，PhamTT，eta1．RNAinterferenceinadultmice．Nature，2002，418：38—3914ElbashirSM，HarborthJ，WeberK，eta1．AnalysisofgenefunctioninsomaticmammaliancellsusingsmallinterferingRNAs．Methods，2002，26：199-21315MiyagishiM，MatsumotoS,TairaK．GenerationofanshRNAiexpressionlibraryagainstthewholehumantranscripts．VirusRes，2004，102(1)：117—12416ZengYCullenBRRNAinterferenceinhumancellsisrestrictedtothecytoplasm[J]．RNA，2002，8(7)：855-860．17BrummelkampTR,BemardsRAgamiR．AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells[J]．Science，2002，296(5567)：550-55318康睿，唐道林，曹励之．RNA干扰在功能基因组学和疾病治疗中应用进展[J】．国外医学儿科分册，2004，3(5)：252．25419RytherRC，FtyntAS，PhillisJA，eta1．siRNAtherapeutics：bigpotentialfromsmallRNAs．GeneTher,2005，12：5-1120deFougerollesA，ManoharanM，MeyersR，eta1．RNAinterferenceinvivo：42 研究论文towardsyntheticsmallinhibitoryRNA_basedtherapeutics·MethodsEnzymol，2005，392：278—29621SeifeddineRDreiemA，BlancE，eta1．Hypoxiadown-regulatesCCAAT／enhancerbindingprotein—Nphaexpressioninbreastcancercells．CancerRes，2008，68(7)：2158—6522Ohkumo互MasutaniC，Eki刀HanaokaF．UseofRNAiinCelegans．MethodsMolBiol，2008，442：129—3723WildaM，FuchsU，WossmannW，eta1．KilingofleukemiccellswithaBCR／ABLfusiongenebyRNAinterference(RNAi)．Oncogene，2002，21：5716—572424WangS，LanF，HuangL，eta1．SuppressionofHlrh-1mediatedbyaDNAvector-basedRNAinterferenceresultsincellcyclearrestandinductionofapoptosisinhepatocelluarcarcinomacellBEL一7402[J]．BiochemBiophysResCommun，2005，333(3)：917-92425HarveyAJ，CromptonMR．UseofRNAinterferencetovalidateBrkasanoveltherapeutictargetinbreastcancer：Brkpromotesbreastcarcinomacellproliferation[J]．Oncogene，2003，22(32)：5006-501026WlliamsNS，GaynorRB，ScogginS，eta1．IdentificationandvalidationofgenesinvolvedinthepathogenesisiofcolorectalcancerusingcDNAmicroarraysandRNAinterference[J]．ClinCancerRes，2003，9(3)：931—94627SongE，LeeSK，WangJ，eta1．RNAinterferencetargetingFasprotectsmicefromfulminanthepatitis[J]．NatMed，2003，9(3)：347—35128刘晓华，张引成，任文豪，等．RNA干扰沉默涎腺粘液表皮样癌Mc3细胞HER2基因表达．华西医学，2010,25(2)：306．30943 综述过氧化物酶体增殖物激活受体Y(PPAR—Y)与相关疾病过氧化物酶体增殖物激活受体(eroxisomeproliferatorsactivatedreceptors，PPAR)，是配体依赖性的转录因子，目前各种疾病关于PPAR的研究取得了突破性进展，部分研究成果已应用于临床。PPAR与甲状腺激素受体、类维生素A受体、类固醇激素受体、及维生素D受体一样，均是核激素受体超家成员之一。因为她能被过氧化物酶体增殖剂(peroxisomeproliferatorsPP)激活，因此被命名为过氧化物酶体增殖剂激活受体peroxisomeproliferatorsactivatedreceptors，PPAR)。PPAR亦被称为脂肪酸受体(fattyacidreceptor)n3，因为还能被内源性脂肪酸及其代谢产物激活。PPAR在糖代谢及脂肪细胞分化中起重要的调节作用，在炎症及冠心病的发病中也起着一定的作用瞳。31，多项研究证实，其在配体的活化作用下，通过诱导结肠癌、肺癌、胃癌等癌细胞的分化、凋亡、抑制血管生成等一系列效应，进而抑制上述癌细胞的生长H刮。在结构上PPAR基因包含5至6个结构区，其中3个为功能域：N一末端、DNA结合区(DBD)和配体结合区(LBD)．如下图。在配体的激活下，PPAR能与目的基因上游的一段特异DNA相互作用，从而调节该基因的转录。DBD国瓤锄rdockingl，Bl，鞋陬l睫ceptordlme一糟li哪’目前PPAR已在多种物种中被发现存在三种亚型：PPARaiPPAR8(亦称PPARI))及PPAR丫四1，其中多种物种的PPAR7，如：人n引、鲑鱼n¨、鼠类m3、蛙m1、猪n43等均已被克隆，是三种亚型中研究最广泛的。人 综述类PPAR7基因定位于染色体3p25，其包含9个外显子，长达100kb。PPAR7包含四个亚类，分别为PPARl,I、PPAR72、PPARl,3、PPAR丫4u5】。最初，科学家们没有发现PPAR的天然配体，因而将其称之为孤儿配体n刨，然而随诊分子生物学及鉴定方法的不断完善，现在已有数百种PPAR7配体被鉴定出来，并被分为合成配体和天然配体两种，有研究表明，一些多聚不饱和酸在微摩尔浓度可以激活PPAR7nH副，而且它的一个不可逆的、选择性的拮抗剂GW9662也被科学家鉴定出来n引。PPARl,主要表达于脂肪组织，除脂肪组织外，在人体中的巨噬细胞及其他脂肪储存细胞，如：肝、肾、肺等中均有表达，肌肉组织基本不表达，PPAR7的主要表现形式是PPARTl，表达范围广泛。研究表明，PPART是参与调解脂肪代谢、脂肪细胞分化、动脉粥样硬化形成，糖尿病、肥胖等的病理过程的重要因子。1PPARY与免疫及炎症PPARy参与炎症及细胞凋亡等病理过程乜0|。相关资料显示，T、B淋巴细胞中存在PPAR佃RNA的表达，PPARy及其配体在炎症及免疫反应中发挥着相应的作用眦1。PPARy在单核／巨噬细胞、T细胞、M(细胞等诸多免疫细胞的分化过程中起着重要的作用乜引。PPAR?及其配体在许多与肺部炎症有关的疾病中发挥了重要作用瞳副。初期，Peraldi等瞳43实验研究发现，在大鼠肥胖模型的脂肪组织中应用PPAR7激动剂TZD能够使TNF．仅的表达降低。Cyzzocrea等心朝发现，在急性肺损伤大鼠模型中，应用PPARl,激动剂15．PDJ2和罗格列酮能够对炎症起到保护作用。ALI(急性肺损伤)是一种临床常见重危病症，其本质是～种因炎症失控而出现的一种过渡的炎症反应乜引，最近相关研究表明，PPAR7在肺组织中广泛表达瞳7。3副，而研究发现PPARl,的抗炎效应对ALI(急性肺损伤)能够起到保护作用[34-36]oWard等b铂研究发现，PPAR7的高亲和性激动剂罗格列酮能够抑制人类气道平滑肌细胞增殖，提出PPARl,可抑制气道重构。Biwell等口81研究LPS诱导的大鼠COPD模型发现，罗格列酮能够抑制气道中性粒细胞浸润。2PPfiRY与糖尿病及其并发症胰岛素抵抗(ⅡD是2型糖尿病的一个主要症状，它是指正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态，主要表现为胰岛素敏感细胞对胰岛素介导的葡萄糖摄取、处置，以及对脂质及蛋白质代谢的抵抗。PPAR7 综述激活后能使脂肪细胞减少TNF一0c和其他信号分子的分泌减少，进而降低胰岛素抵抗，相对增加胰岛素敏感性，部分改善2型糖尿病的糖耐量。此外，PPAR7也可通过调节葡萄糖和脂肪酸的代谢过程，加快脂肪酸的消耗，进而改善胰岛素的敏感性。而且，PPAR7能够形成PPARoRXR二聚体，增加WAT中总胆固醇的含量，是肝脏／肌肉中的TG含量降低，改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗。大血管病变是2型糖尿病的一个主要并发症，更是2型糖尿病患者致残、早死的一个重要原因。2型糖尿病患者血液循环中存在的炎性细胞粘附于血管内皮细胞(ⅦC)是AS早期重要的一步。研究发现，PPAR7激动剂TZD、15．PDJ2能够将二酰甘油激酶(DGK)激活，进而减少二酰甘油激水平，使DGK-PKC信号通路受到抑制，从而使高血糖引起的炎症前粘附分子的表达受到抑制，并干扰单核细胞的粘附，并且，这种抑制作用具有PPAR7受体依赖性n引。研究证实，PPAR7能够干扰AP．1信号途径，从而减少ET-1(内皮素一1)的分泌及其随后出现的血管痉挛及致AS作用，对血管壁存在保护作用H叫。AS形成中期，血管平滑肌细胞(VSMC)将会从具有收缩功能的细胞转变成为具有增殖和分泌功能的细胞，PPAR-7激动剂能在体外抑制VSMC增生、迁移及血管再狭窄。Goetzec4妇等研究发现，PPAR-7配体如：罗格列酮、曲格列酮、15d-PGJ2都可以抑制平滑肌细胞的迁移。有研究发现NF．kB及PPAR-7增强子若被同时激活并相互作用能够干扰炎症前因子TypeII-PLA2基因的转录，这可能为PPAR-7抑制平滑肌增殖的又一机制。3PPARY与高血压高血压是最常见的心血管病，是全球范围内的重大公共卫生问题，严重危害着人类的健康，常引起心、脑、肾等重要器官的病变并出现相应的后果，目前尚无根治办法。从分子水平探讨高血压发生、发展的机制并寻求新的治疗靶点，已成为当今世界医药卫生的重大课题。PPAR-7在体外培养的人血管内皮细胞H21及血管平滑肌细胞H31中均能检测到表达，自发性高血压大鼠(SⅧ℃)模型的胸主动脉及肠系膜动脉血管组织中PPAR-7的表达量明显高于同龄的WKY大鼠H4J，研究发现，作为PPAR-7的激动剂，罗格列酮、匹格列酮均有不同程度的降压作用H5‘4引。激活PPAR7能抑制心肌细胞蛋白质合成，能抑制血管平滑肌细胞的增殖、凋亡和细胞外基合成，调节细胞内活性物质的释放，并且，PPAR7通路 综述的激活，能改善高血压所致的心脏、血管重构。大量的临床及动物实验表明，激动P啪或者PPAR-7的活性增强，均可阻止血压的升高，PPAR-y可以作为一直血压升高的一种保护因子。4PPARY与骨代谢近年来，大量的研究表明，PPARy也是骨髓间充质肝细胞及造血肝细胞分化的重要调控因子。PPAR7是参与骨重建的重要调控因子之一，研究表明，随着年龄的增加，体内PPARy天然配体的水平随之升高，其中Ox．LDL、15d-PGJ2、白三烯B4在骨重建中发挥负调控作用，共轭亚油酸有利于骨形成，但具体机制尚不明H7。57l。Elbrecht畸81等发现，骨髓间充质干细胞中有PPARy的表达，其在造血干细胞想破骨细胞分化的过程中发挥独立的调控作用。活化后的PPAR7能够抑制骨髓间充质肝细胞分化为成骨细胞，并促进其向脂肪细胞分化畸9。61|。相关研究也发现，使用TZDs治疗，能够诱导骨髓间充质干细胞分化成脂肪细胞嗽3。Park等∞∞研究PPARy的一种新的激动剂KR62776发现，KR62776对破骨细胞的分化和活性起负调控作用。药理学研究表明，PPAR?被其人工合成配体罗格列酮激活后，能促进破骨细胞分化及骨吸收致小鼠骨量减少瞰1。PPAR7与骨代谢之间的关系及作用机制仍在不断的探索中，其作用机制的明确，有望成为骨代谢疾病治疗的新靶点。5PPARY与肿瘤：PPAR一／除有上述功能以外，其与肿瘤的形成亦密切相关，PPAR7在不同种类癌细胞中表达，由自然配体或药物配体激活的PPARl,激活体既可以产生细胞增殖的抑制作用，又有可能诱导细胞凋亡或终末分化作用，目前的相关研究认为，PPAR7活化后能够抑制肿瘤的发生的机制主要涉及到引起肿瘤细胞的细胞周期停滞于G1／G2期，诱导细胞分化哺淌3)，抑制肿瘤血管生成旧删，诱导肿瘤细胞的凋亡睁7∞等多个环节。多数研究支持肿瘤恶性程度越高，PPAR7的表达越强，但也有相反的结果。5．1PPARY与肺嘀根据组织学类型的不同，不同肺癌的PPARy的表达存在明显差异，其中由低到高分别为：腺癌、大细胞肺癌、鳞癌、小细胞肺癌，不同分化程度的肺癌中高分化肺癌组织中PPAR7表达量显著低于低分化者。正如InoueK等n妇关于肺癌的研究表明，PPARy在肺癌组织中有表达，且与组 综述织学类型、细胞分化及TMN分期相关。Chang口21等研究发现，超过50％的人肺癌均有PPARy蛋白的表达，其中肺腺癌表达最高，在非小细胞肺癌中均能发现PPARymRNA及蛋白的表达。大量体外实验在多种肺癌细胞株上均能检测到PPARy的表达，某些PPARy激动剂如TZDs可以呈时间和剂量依赖性抑制肺癌细胞的生长和诱导其凋亡。有研究显示多不饱和脂肪酸可以抑制肺癌细胞的生长，其原因可能与其增加了PPAR7在肺癌细胞中表达有关。并且相关研究表明，PPARy的配体激动剂作用于肺癌细胞后，能够诱导肺癌细胞凋亡及终端分化，进而抑制肺癌细胞的生长[73-75]。相关研究显示，RGZ、CGZ和15d．PGJ2在肺腺癌细胞能够激活PPARy，但在肺鳞状细胞癌及肺大细胞癌的细胞中却没有发现相同的作用。6．2PPfiRY与肝癌大量研究表明，PPARy与肝癌的形成关系密切，但目前在肝癌的研究中出现了两中不同的结论，部分研究显示，PPARy的表达在癌组织中要高于癌旁组织，这说明PPAR7可能参与肝癌的形成，Schaefer等口胡实验中发现：肝癌组织中PPARl,的表达高于癌旁组织及远离癌灶的良性肝组织。我国学者郭雷鸣订73等研究发现，PPARy在肝癌组织表达高于癌旁组织，认为PPARy参与肝癌的发生。然而Yu等口83发现，PPARy激动剂陆格列酮能诱导肝癌细胞中PPAR3,的表达，使p27Kipl与：p21蛋白表达上调，进而阻滞肝癌细胞的细胞周期，抑制COX．2表达，抑制肝癌细胞的增殖并诱导其凋亡，能起到抑制肿瘤生长的作用。Koga口卯等于人肝癌组织及HAK-5、HAK-1B、HAK．1A、HUH-7、HLF等肝癌细胞系中均检测到PPARy的表达，发现TGZ通过下调Skp2和诱导p27kipl相关的细胞周期阻滞，使肝细胞生长受到抑制。Okano阳∞等研究报道，肝细胞癌配体15d—PGJ2能增强肿瘤坏死因子成员Fas，进而介导肿瘤细胞凋亡。这些研究结论显示PPAR一／的激动剂及其有抑制肝癌细胞生长的作用。5．3PPARY与胃癌胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位。大量学者已经就PPARy与胃癌的关系及机制进行了大量相关的实验，Sato等髓妇在伴肠化生的胃粘膜以及胃癌的高、中、低分化腺癌中均检测到PPARy蛋白的表达，并检测到PPARY蛋白的表达量随着胃粘膜异型程度 综述的增高而增加，同时，他们发现，PPARy激动剂对对胃癌细胞增殖有抑制作用，剂量越大，抑制作用越强，而且，当有RXR配体9．顺式维甲酸存在时，抑制效用可增强。幺立萍圈21等的实验中通过免疫组化法证实，PPARy在慢性胃炎中到胃粘膜不典型增生中再到胃癌中，其表达量呈上升趋势。马秀梅等随3瑚研究发现，PPAR7mRNA及其蛋白的表达水平从正常胃粘膜、癌旁粘膜到胃癌组织呈递增趋势，说明PPARy可能与胃癌的发生发展有关。Leung等瞰3指出，PPARy配体环格列酮能够显著抑制胃癌细胞MKH45的生长，此作用与其能够上调p53，及下调bcl．xl、bcl．2、cyclinEl的表达有关。朱理辉等随鄹研究表明，罗格列酮能通过使PTEN的表达上调使得胃癌MGC803细胞停滞于细胞周期G1期，抑制该细胞株生长。这说明不仅存在于胃癌组织中有PPAR7的表达，无癌细胞的人类健康胃粘膜组织中同样存在PPAR3,的表达，并且其激动剂在抑制胃癌细胞的生长方面也有非常显著的作用。5．4PPAItY与食管癌食管癌是世界一些国家和地区常见的恶性旦蝗，占所有恶性肿瘤的2％，年平均死亡率为1．3-90．9／10万，我国是食管癌高发地区，位居肿瘤死亡的第四位，因此对食管癌病因及治疗的探索目前仍是人类面对的一项艰难的课题。Rumi等对EC．GI．10及T．T、T．Tn食管癌细胞株的研究表明，上两种肿瘤细胞中PPARy均高表达。而Terashita等对共55例原发性食管癌患者进行研究表明：食管癌细胞中的PPARymRNA表达明显下降，伴有广泛的淋巴结转移的患者癌细胞的PPARymRNA表达量更低，表达量低的患者术后生存时间明显较表达量高者短。研究显示，PPAR7的合成及天然配体都表现出对食管癌细胞的生成呈剂量依赖性抑制。5．5PPAllY与大肠癌(结肠癌)结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，也是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一。近年来，我国结肠癌的发病率越来越高。Mansen等随63通过免疫组化及Western实验发现鼠的大肠及小肠粘膜均表达PPAR7，并且大肠中的表达量高于小肠。．Lefebvre等陷刀通过研究发现人类及啮齿类动物的大肠中的PPAR7mRNA及其蛋白的表达高于小肠中的PPARymRNA及其蛋白的表达水平，且PPARy全部分布在分化较好的大肠粘膜的细胞。相关研究显示，PPARy的配体能够促进大肠癌细胞的凋亡，并 综述能够促进其分化、抑制其生长碡8I，PPAR7代表性配体噻唑烷二酮能够抑制PPARy阳性的大肠埃细胞系HT-29的生长和转移睛9|。Kitamura等阳们在其研究中发现，人类结肠癌细胞系中PPAR3'的表达较正常组织明显升高，激活PPAR一／后可抑制结肠癌细胞的生长。李传风∞妇等的研究显示PPARy蛋白及mRNA在正常大肠粘膜及大肠腺瘤细胞中的表达无显著差别，但在大肠癌中的表达明显高于正常大肠粘膜及大肠腺瘤细胞，而在重度异型增生腺瘤中的表达接近于大肠癌。沈丹等∞23通过其研究发现结肠癌组织中PPARl,呈现高表达，且阳性率显著高于正常结肠组织，而PPARl,激动剂能够通过时间和剂量依赖的方式抑制LSl74T和SW480结肠癌细胞生长。Osawa等凹31的研究也证实，PPARy在大肠癌组织及癌细胞株中呈现高表达，而PPARy的激动剂能够减轻小鼠结肠粘膜的癌前损伤，降低小鼠结肠癌的发生机率。同时相关研究还表明PPARy蛋白在中高分化结直肠癌组织中的表达高于低分化或未分化癌，浸透浆膜层的癌组织中的表达高于浆膜层以下者，发生远处转移和和有淋巴结转移者高于无远处转移和无淋巴结转移者。但是，大肠肿瘤中PPARy升高的原因尚未明确，Chen等四钔考虑大肠肿瘤中PPAR7升高可能是代偿性的。Brockman等一朝的研究提示在大肠肿瘤中PPARy的内源性配体存在缺陷，在无外源性配体存在时不充分激活PPAR3,。而Kato等∞胡用PPAR7配体曲格列酮处理结肠癌细胞HCT-15后发现该细胞的增殖受到抑制，细胞凋亡明显增加，分化标志物÷绒毛蛋白及粘蛋白成显著表达。Sunami等凹刀研究显示，PPARy配体曲格列酮能显著抑制结肠癌细胞株HT-29细胞的增殖及肿瘤侵袭相关基因MMP．7的产生，而且能够使HT-29细胞克隆株2l与细胞外基质、层黏连蛋白圾Ⅳ型胶原蛋白的的粘连显著降低，进而使结肠癌细胞的转移受到抑制。5．6PPARg与胰腺癌近些年来，胰腺癌的发病率在国内外呈现出逐渐上升的趋势，其起病隐秘，发展迅速，缺乏有效地早期诊断、系统治疗的方法，导致胰腺癌早起诊断及治疗水平较低，这就促使人们不断寻求新型的并且有效的治疗分子靶点凹8l。人胰腺癌细胞中的PPARl,的表达及作用机理到目前为止并没有得到完全阐明凹引。Motomura等n删在4个胰腺癌细胞系PK-1、PK-9、MIAPara．2和PK-8中应用RT-PCR(逆转录一聚合酶链反应)等方法检测 综述到了PPARymRNA，发现曲格列酮能够以剂量依赖的方式抑制上述胰腺癌细胞的生长，并通过研究发现应用曲格列酮能使PK-1细胞的生长停滞于G1期。王兴鹏n013等研究证实，人类胰腺癌细胞中存在PPARy的表达，并且证实PPARy通过依赖其与维甲酸受体0【(RXR仅)结合形成的二聚体来发挥其信号传导作用，通过研究还发现人胰腺癌细胞PC一3仅存在着PPARy的表达。Ceni等n021的研究发现，将罗格列酮同表达PPARy的胰腺癌细胞株PANC21一起孵育72h后，PANC21细胞出现明显的形态学改变。部分国内学者研究结果显示，在人胰腺癌细胞系SWl990中存在着PPAR7及RXRQ的高表达，并且PPARy及RXR伐的特异性配体9．cis．RA、15d—PGJ2对胰腺癌细胞系的增殖呈剂量依赖性的抑制作用，PPARy活化具有显著地抑制胰腺癌细胞生长的作用，提示PPAR7可能是一个治疗胰腺癌的潜在靶点。Toyota等n031报道，活化胰腺癌细胞中的PPAR丫能够使CyclinDl及细胞周期相关蛋白E2F1的表达水平降低，使细胞周期停滞于G1期，但是PPARy活化对正常的胰管上皮细胞的CyclinDl无影响。Farrow等n041指出，罗格列酮作为PPARy激动剂，能使胰腺癌细胞AsPCI的PTEN的表达增强，使AKT的磷酸化受到抑制，同时给予PPAR7的抑制剂GW9662后发现PTEN的表达受到抑制，他们认为PPARl,配体能够诱导肿瘤抑制基因PTEN的表达，抑制P13K的活性进而抑制胰腺癌细胞的生长，并且PPAR7活化具有抑制肿瘤细胞侵袭的潜能。5．7PPARY与乳腺癌Burstein等n051在其试验中用曲格列酮治疗乳腺癌的II期临床试验表明，PPAR7配体／、激动剂是治疗进展期乳腺癌的新途径。Badawi等n061通过动物实验证明，激活PPARy同时抑制bcl．2更能够有效地阻碍鼠乳腺癌的形成。而Saez等n071在动物实验中繁殖一种具有乳腺癌表达活性的PPARy转基因鼠，并使其与另一种有乳腺癌发生倾向的转基因鼠交配，其后代以一种加速度的动力学状态发展成肿瘤，表明在特性情况下激活PPARy能够加速肿瘤的发生及发展，进一步的研究证实，若已经有起始时间发生于乳腺组织，则增强PPARy途径会促进乳腺肿瘤的发展。Eisner等n删研究发现，(体外和小鼠体内的)PPARy激动剂／配体能抑制乳腺癌细胞生长，PPAR7蛋白的高表达可能作为一种区别乳腺癌细胞和正常乳腺细胞的标志。但是有研究表明，PPARqt对于乳腺癌可能是一个具有保护作用的因 综述素，Rubin等n嘲发现，PPAR7配体能降低乳腺癌细胞本身的侵袭能力及其血管的生成能力，进而降低乳腺癌在局部复发的机率，因乳腺导管癌治疗后发生局部复发的患者或者死亡的患者体内的PPAR7mRNA表达水平比无瘤生存者要低得多。Qin等n101等的研究表明，激活乳腺癌细胞的PPAR7表达后能够阻碍乳腺癌细胞的增殖及乳腺癌细胞由G1／Go期向S期的发展，进而抑制乳腺癌细胞的增殖。Suzuki等nn3通过免疫组化检测发现，乳腺癌细胞的PPAR7阳性率为42％，与肿瘤的组织学分级呈负相关。部分国外学者的研究发现PPARy同ERs和PR呈正相、关，激活PPAR7能够抑制ElLs与特异性靶基因的结合能力，阻断雌激素信号传导的途径，是ERs阳性乳腺癌患者比较好的预后判断指标。但与之相反的是，Papadaki等n123应用免疫组化方法研究却发现PPARl,与ERQ的关系不具有统计学意义，而是与ERB相关，是ERB阳性乳腺导管癌患者无瘤生存期及总生存率的一个较好的预后指标。用PPAR7配体，包括15d-PGJ2和TZD(如Tro)处理乳腺癌细胞，能够抑制乳腺癌癌细胞的生长n131。5．8PPLRg与妇科肿瘤5．8．1PPARY与宫颈癌宫颈癌的发病率在全球女性肿瘤的发病率中排第3位、死亡率占第4位n14|。早期的宫颈癌可以经手术或放疗达到临床治愈，但是较晚期者治疗的临床效果并不理想。宫颈癌的发生是多阶段、多步骤、多因素发展的过程，具体的机理尚不清楚，从基因水平上寻找宫颈癌相关靶点成为治疗宫颈癌的新思路。阿仙姑·哈斯木等n151报道，PPAR7的表达从慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤到宫颈癌逐渐增高，而宫颈上皮内瘤及宫颈癌中PPAR7的表达较正常的宫颈组织显著增高。盛立红等n163通过研也发现，宫颈癌中PPAR7的表达高于正常宫颈、宫颈上皮内瘤(CN)及慢性宫颈炎，其表达的高低与分化程度、有无淋巴转移有关，与宫颈癌患者的年龄、临床分期和组织学类型均无相关性。5．8．2PP／LRY与卵巢癌卵巢癌是我国常见的恶性肿瘤，也是妇科恶性肿瘤中死亡率最高的，其发病率仅次于宫颈癌及子宫内膜癌，卵巢癌起病隐匿，不易早起临床诊断。近些年来对卵巢癌的分子生物学认识已经取得了较大的进展，不过尽管针对卵巢癌肿瘤细胞减灭术及化疗水平已经不断改进，但是卵巢癌患者 综述的五年生存率并没有显著提高，探索卵巢癌早期诊断及治疗的新靶点已十分必要。相关的研究报道，上皮性卵巢癌细胞中PPAR7存在显著表达n171。Zhang等n181在试验中通过免疫组化技术研究发现，PPAR),在正常卵巢组织细胞中不表达，而在癌组织中显著表达，且表达部位与肿瘤的分化程度有关，卵巢恶性肿瘤的PPARy的免疫反应与良性及交界性肿瘤相比明显增加，经Westernblot分析显示，低分化型卵巢癌的PPARy的表达与良性及交界性肿瘤相比明显增加。Yang等n朝报道，经PPAR7配体环格列酮处理过的卵巢癌细胞株ES．2和PA．1，细胞的生长明显出现抑制，并且凋亡增加。Lei等n2们等通过他们的研究发现，卵巢癌细胞株SKOV3经PPAR),配体DM．C-pPhtBu(p．t．butyl—substiutedC—DMcompound)处理后SKOV3细胞株出现增殖阻滞，作用途径可能与依赖和非依赖PPAR7途径有关，具体机制尚未完全明确。5．8．3PPARY与子宫内膜癌子宫内膜癌是较常见的、发病率逐年上升的妇科肿瘤之一，据统计显示，近年来子宫内膜癌的发病年龄有逐渐提前的趋势，随着分子生物技术的出现和迅猛的发展，多个癌基因及抑癌基因发生突变时的协同和拮抗作用己逐渐成为子宫内膜癌分子生物学研究的方向，因为PPARy与雌激素、胰岛素抵抗等子宫内膜癌的高位因素关系密切，目前PPAR7已成为内膜癌研究的新位点。CathrineM．Holland等n2玎通过微列阵试验指出，子宫内膜癌中随着转录的改变，PPARot，丫表达出现上调，而RXRp出现下调。王红霞等n223报道，PPARl,在子宫内膜癌细胞中存在表达，PPAR一、／配体罗格列酮能够抑制子宫内膜癌细胞系的生长，促进肿瘤细胞的凋亡，并且该作用呈时间及计量依赖性，考虑这种抗肿瘤机制可能是通过活化PPARy途径实现。孔蕾等n233的研究显示，从正常子宫内膜到单纯性增生子宫内膜到复杂性增生子宫内膜到子宫内膜不典型增生再到子宫内膜腺癌，PPARy的阳性表达率逐渐升高，PPAR7在I型子宫内膜癌中阳性表达率高于II型，I型子宫内膜癌中，PPAR一、／的阳性表达率与组织学分级、FIGO分期呈正相观，而在II型子宫内膜癌中，PPAR7的阳性表达率与组织学分级、FIGO分期无明显关系，在预后较差的宫内膜鳞癌、透明细胞癌、浆液性腺癌中PPARy的阳性表达率极低或低表达，提示PPAR),可作为检测内膜癌预后的指标。AlessandraRe，M．D．等n241等研究指出，子宫内膜癌 综述与乳腺癌之间存在相同的病因学，包括共同的治病环境及相同的发病基因，因此他们推测，PPARy激活后，同样可能诱导内膜癌细胞的凋亡。李明等n2朝在研究中发现，人卵巢细胞在PPARy、RXR等激动剂处理前后均能使芳香化酶的活性受到显著抑制，而两者结合使用后抑制作用进一步加强，同时伴有P450芳香化酶mRNA表达水平的下降，这说明，PPAR7激动剂能够通过对芳香化酶的抑制进而抑制雄性激素诱发的细胞增殖及细胞内芳香化酶mRNA表达水平的升高，能够作为有潜力的治疗雌激素依赖性肿瘤的药物。6结语PPARy在多种疾病中均发挥相应的作用，使其作为多种疾病治疗靶点成为可能，是目前国内外研究的热点之一，但PPAR7在多种疾病中发挥作用的机制复杂，在部分疾病中的作用甚至尚存在争议。目前大量研究表明，PPARy表达与肿瘤的发生、发展关系密切，PPARY激动剂有抗肿瘤的作用，其机制可能包括：抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制血管生成、抑制癌细胞转移等，但是仍有相反的结论表明PPAR7能促进肿瘤的生长转移，因此PPAR7与肿瘤之间的具体作用机制尚待进一步研究阐明。此外，目前关于PPAR7与肿瘤之间关系的研究均以体外培养的肿瘤细胞及动物作为研究对象，得出的结论尚不能完全适用于人类，并且，目前尚没有充足的研究结论证实其对人体肿瘤的有效性和安全性。综上所述，关于PPAR7的研究尚未透彻，前景非常广泛，有望在日后成为多种疾病及肿瘤的治疗靶点。参考文献lIssemannl，Greens．ActivationofaMemberoftheSteroid-HormoneReceptorSuperfamilybyPeroxisomeProliferators．Nature，1990，347(6294)：645—6502WansonEM，LanganAS，VorceRL，etad．Sodiumarseniteinhibitsandreversesexpressionofadipogenicandfatcell-specificgenesduringinuitroadipogenesis．ToxicolSci，2002，65：21l一2193MurphyGJ，HolderJC．PPAR-gammaagonists：therapeuticrolein 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综述cancer：clinicalvalueandcorrelationwithERb[J]．Histopathology，2005，46：37-4213KoutnikovaH，AuwerxJ．PPARgamma，anX-ceptorforXs[J]．AnnNYAcadSci，2002，967：28-33l14JemalA，BrayF，CenterMM，eta1．Globalcancerstatistics[J]．CACancerJClin，2011,61(2)：69—90115阿仙姑·哈斯木，拉莱·苏祖克，李巧稚．PPARY在子宫颈上皮内瘤样变和宫颈癌中的表达及意义[J】．新疆医科大学学报，2007，30(6)：601．．603116盛立红，王辉，张绘宇，等．过氧化物酶体增殖物激活受体y(PP创oY)在宫颈癌中的表达及意义[J】．齐齐哈尔医学院报，2006，27(10)：1l56—115817SakamotoA，YokoyamaY，UmemotoM．eta1．Clinicalimplicationofexpressionofcyclooxygenase-·2andperoxisomeproliferatoractivated—receptorgammainepithelialovariantumous．BrJCancer，2004，91(4)：633-63818ZhangGY，AhmedN，RileyC，eta1．Enhancedexpressionofperoxisomeproliferator-activatedreceptorgammainepithelialovariancarcinoma．BrJCancer,2005，92(1)：113—11919YangYC，TsaoYP，HoTC，eta1．Peroxisomeprolifemtor—activatedreceptor-gammaagonistscausegrowtharrestandapoptosisinhumanovariancarcinomacelll证es[J]．IntJGynecolCancer，2007，17(2)：418—425120LeiP，AbdelrahimM，SafeS．1，1-Bis(3'-indolyl)一1一(p—substitutedphenyl)methanesinhibitovariancancercellgrowththroughperoxisomeproliferator-activatedreceptor-dependentandindependentpathways[J]．MolCancerTher，2006，5(9)：2324—2336121CathrineM．Holland，AmandaL．Evans，AndrewM．Sharkey，eta1．Transcriptomeanalysisofendometrialcanceridentifiesperoxisomeproliferator-activatedreceptorsaspotentialtherapeutictargets．MolCancerTher,2004；3：993—1001122王红霞，张贵宇．PPARs在子宫内膜癌腺癌细胞中的表达及其激动剂 综述对子宫内膜癌细胞生长抑制的影响[J】．现代妇产科进展，2007，16(2)：l14．117123孔蕾，张家文，于甬华，黄伟，等．PPARy、PTEN、P27酬P在雌激素依赖性和非雌激素依赖型子宫内癌中的表达及其临床意义．中国妇产科临床杂志，2007，8(6)：442．444124AlessandraRe，M．D．ThomasH．Taylor，Ph．D．eta1．RiskforBreastandColorectalCancersSubsequenttoCanceroftheEndometriuminaPopulation-BasedCaseSeries．GYNECOLOGIC0NCOLOGY66，255—257(1997)125李明，母义明，等．核受体激动剂对人卵巢癌细胞核乳腺癌MCF一7细胞芳香化酶的调节作用．第二军医大学学报，2003，Jun；24(6)：640．644 致谢值此论文完成之际，衷心的感谢我的导师陈彦平主任对我的悉心教导，研究生三年期间，陈老师无论在生活、学习还是在工作上始终给我无微不至的关怀，她的谆谆教导让我受益匪浅，从课题的设计、准备到实验的开展再到最后论文的完成，陈老师投入了大量的精力并给予了我大量的帮助，严谨的工作作风、一丝不苟的治学态度、高尚的人格、崇高的医德、渊博的知识、精湛的技术，始终是我学习的楷模，是我终身追赶的目标。衷心感谢答辩委员会的各位专家、评委，学位办的各位老师对本课题的帮助与指导。衷心感谢河北医科大学第四医院病理科刘月平主任、杨会钗主任医师，科研中心艾军老师在实验过程中给予的指导与帮助。衷心感谢河北医科大学研究生学院全体老师在学习、工作、生活上的无私的关心与帮助。衷心感谢河北医科大学第四医院口腔科全体老师及护士在临床实习、生活、实验中给我的热心指导和帮助。衷心感谢河北医科大学第四医院口腔科各位师兄、师弟、师妹对我学习、工作、生活及实验中的关心与帮助。衷心感谢我的爸爸、妈妈及所有的家人，他们是我的坚强后盾。衷心感谢所有关心我的、在各方面帮助过我，但却无法在此一一列举的老师、同学和朋友们。 个人简历一一般情况姓名杨鹏性别男民族汉出生日期1986年1月28日籍贯河北省保定市清苑县二个人经历2002年9月．2005年7月清苑中学2005年9月．2010年7月河北医科大学临床学院2010年9月．至今河北医科大学三获奖情况2011-2012学年河北医科大学校级优秀硕士研究生2011．2012学年河北医科大学研究生学院一等奖学金