钙黏素家族相关基因与涎腺腺样囊性癌转移的关系

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1、钙黏素家族相关基因与涎腺腺样囊性癌转移的关系作者：佘林，丁林灿，王锦锋，卢友光【摘要】　　目的筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的钙黏素(CDH)家族基因。方法对涎腺腺样囊性癌转移能力不同的两个细胞株的基因表达谱进行生物信息学分析，筛选出可能与转移相关的CDH家族基因，通过荧光实时定量PCR技术对相关基因的表达差异进行验证，并用免疫组织化学技术研究有差异的CDH基因在临床样本中的表达及其与转移的关系。结果生物信息学分析发现，表达谱中有14个CDH家族基因在两个细胞株中的表达有差异，实时定量PCR验证发现CDH4、CDH5、CDH12在两细胞株之

2、间的表达差别有统计学意义(P<0.05)，免疫组织化学发现CDH12在有转移的临床标本中的表达高于没有转移的标本((P<0.05)。结论CDH12可能与涎腺腺样囊性癌的高转移能力有关。【关键词】癌,腺样囊性；涎腺肿瘤；钙黏着糖蛋白类；聚合酶链反应；免疫组织化学　　ABSTRACT:ObjectiveToexploretherelationshipoftheexpressionofcadherinfamilygenesandthemetastasisofadenoidcysticcarcinoma.MethodsThegenes

3、ofadenoidcysticcarcinomaaticsanalysisfromACC2andACCMgeneexpressionspectra.ThecorrelativegenesinvolvingCDHfamilyined.RealtimePCRinethemRNAlevelofthesegenesintheACC2andACCM.Thenimmunohistochemicalmethodsa.ResultsForteenkindsofgenesgeneexpressionprofile.RealtimePCRdemo

4、nstratedthattheexpressionofCDH4andCDH12inACCMetastasisandrecurrencethanayplayanimportantroleinthemetastasisofadenoidcysticcarcinoma.　　KEY和低转移细胞株ACC2由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤实验室惠赠。其中ACCM为ACC2经过裸鼠体内连续传代培养分离出的高转移细胞株。免疫组织化学标本为1998-2008年福建医科大学附属第一医院和福建医科大学附属协和医院手术切除并经病理确诊

5、为涎腺腺样囊性癌的肿瘤石蜡组织标本，其中发生转移的23例，未转移57例。　　1.1.2主要试剂　　Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、PrimeScriptRTreagentKit（日本TaKaRa公司）、SYBRPremixExTaq(日本TaKaRa公司)、CDH12抗体(美国RD公司)、UltraSensitiveSP超敏试剂盒、磷酸盐缓冲液PBS、柠檬酸盐抗原修复液、加强型DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。　　1.1.3主要仪器　　梯度PCR仪(MastercyclerGradient5331，德国

6、Eppendorf公司)、荧光定量PCR仪(TP800，日本TaKaRa公司)、GeneSnap凝胶成像系统(InGeniusLHR，英国SynGene公司)、石蜡自动包埋脱水机（H2245，德国LEIca公司）。　　1.2方法　　1.2.1筛选CDH家族基因　　根据卢友光等构建的涎腺腺样囊性癌基因表达谱，进行生物信息学分析，使用图像分析软件测量出所有片段在凝胶上的迁移距离[5]。SAS统计软件进行曲线拟合，找出最佳拟合曲线，计算各片段bp值。根据拟合结果，以片断大小和所在“表达窗”作参数，按2％容许误差从数据库(QbiogeneInc

7、．＆MPBiomedicalsInc公司提供)确定其所对应的基因，每个片段数据均与NCBIGeneBank直接链接，从而对涎腺腺样囊性癌的基因表达谱进行分析初步得出与CDH家族相关基因14种。通过NCBIGenebank和UCSC查询14种基因的序列，使用Primer3(v.0.4.0)在线设计引物（表1），引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表114种基因以及内参照引物（略），Tab114kindsofgenesandinternalreferenceprimer（略）。　　1.2.2实时定量荧光PCR　　通过Trizol法抽

8、提RNA，用紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。纯度和浓度达到实验要求后，将各个样品总RNA稀释至相同浓度，使用PrimeScriptRTreagentKit逆转录试剂盒逆转录为cDNA。荧光