notch信号通路相关基因的表达与涎腺腺样囊性癌转移的关系

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1、Notch信号通路相关基因的表达与涎腺腺样囊性癌转移的关系作者：卢友光佘林林李嵩张声丁林灿【摘要】目的筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的Notch信号通路基因。方法对已构建的涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株ACCM、ACC2基因表达谱进行生物信息学分析，在与Notch信号通路基因进行比对后，筛选出差异基因，通过荧光实时定量PCR技术对相关基因的表达差异进行初步验证。结果涎腺腺样囊性癌的表达谱中有46个基因与Notch信号通路有关。验证发现，Notch1,Notch2,Notch4，CHUK，FOXC1，FZD2，FZD3，GBP2和RU

2、NX1在2个细胞株中的表达差别有统计学意义(P<0.05)，同时Notch1在发生转移的涎腺腺样囊性癌中的表达明显高于未发生转移的涎腺腺样囊性癌（P<0.05）。结论Notch信号通路中的多个基因可能参与了涎腺腺样囊性癌的发生和发展；Notch1的表达与涎腺腺样囊性癌的发生、转移密切相关。【关键词】癌，腺样囊性；涎腺肿瘤；聚合酶链反应；细胞，培养的；基因表达；信号传导涎腺腺样囊性癌是口腔唾液腺常见的恶性肿瘤之一，该肿瘤的恶性程度高，术后易于复发，患者预后较差。目前认为多种分子涉及该肿瘤的发生发展及转移，包括P53、P16、

3、P27、MMPs等。Notch信号通路是一条古老的信号通路，相邻细胞通过Notch信号通路的传递，决定细胞的增殖或凋亡，它参与胚胎发育，T细胞的发育，以及维持造血干细胞自我更新等。笔者采用第二代差异显示技术构建了涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株的基因表达谱，通过生物信息学分析和半定量RTPCR，发现Notch基因家族4个成员在ACC2，ACCM2个细胞株间存在表达差异[1]。本研究采用荧光定量PCR进一步验证Notch基因家族在这2个细胞株中表达的差异，分析Notch信号通路42个主要相关基因表达的变化，寻找与涎腺腺样囊性癌转移相关的基

4、因。1材料与方法1.1材料人涎腺腺样囊性癌高转移细胞株ACCM和低转移细胞株ACC2由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤实验室惠赠。其中ACCM为ACC2经过裸鼠体内连续传代培养分离出的高转移细胞株。免疫组织化学标本为福建医科大学附属第一医院手术切除并经病理确诊为涎腺腺样囊性癌的肿瘤石蜡组织标本，其中发生转移者11例，未转移者14例。1.2主要试剂和仪器Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；PrimeScriptRTreagentKit、SYBRPremixExTaq(日本TaKaRa公司)；Notch

5、1兔多克隆抗体(美国Neomarker公司)；UltraSensitiveSP超敏试剂盒、磷酸盐缓冲液PBS、柠檬酸盐抗原修复液、加强型DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。MastercyclerGradient5331PCR仪(德国Eppendorf公司)；TP800荧光定量PCR仪(日本TaKaRa公司)；GeneSnap凝胶成像系统(英国SynGene公司)；石蜡自动包埋脱水机、连续切片机（德国LEica公司）。1.3筛选Notch信号通路相关基因根据2.2Notch1在转移及非转移涎腺腺样囊性癌组织中的表达通过S

6、P三步法，镜下可见Notch1蛋白定位于细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒，在涎腺腺样囊性癌的肿瘤细胞中散在表达。在腺样管状型中，阳性细胞主要位于腺管样结构，而在实性型中则散在分布在癌细胞团中（图2A、B）。在发生转移或复发的病例中，Notch1蛋白的染色深度及染色细胞数明显强于无转移者，在11例转移复发病例中，有7例呈强阳性表达（图2C），占63.6%；而在无转移病例中仅14.3%（图2D）。两者病例表达情况见表2。表2Notch1蛋白在涎腺腺样囊性癌的转移复发病例中的表达A:卵巢癌阳性对照组织,细胞内出现棕黄色颗粒,蛋白表达位于细胞

7、质;B:涎腺腺样囊性癌阴性对照组织,蛋白没有表达;C:复发与转移的涎腺腺样囊性癌,细胞内出现深棕黄色颗粒,蛋白表达位于细胞质;D:未发生转移的涎腺腺样囊性癌,细胞内出现淡棕色颗粒,蛋白表达于细胞质.3讨论Notch信号通路是一条古老的通路，其与胚胎发育、T细胞发育，以及维持造血干细胞的自我更新密切相关。目前研究表明，肿瘤、神经系统疾病、先天性发育异常等都与该通路表达异常有关。Parr等通过RTPCR技术得出，Notch1和Notch2在乳腺癌的病人中的表达高于正常乳腺组织；并且在乳腺癌的发生、发展上起不同作用。Notch1在低分化

8、的乳腺瘤中表达增加而Notch2的表达下降，但在分化良好的乳腺癌中出现高表达；Notch2则起到抑癌作用[8]。Kobayashi等构建急性肾损伤局部缺血在灌注损伤的小鼠模型，发现Delt